植物组织培养实验中相关的问题答案(3)

解答了组培中玻璃化 培养基过软等相关的问题

物，是将原始寄主嫁接到指示植物上。指示植物法简便易行，成本低，但它灵敏性差，所需时间长，难以区分病毒种类。

2.酶联免疫吸附测定（ELISA） ELISA是一种免疫酶技术，它是本世纪70年代在荧光抗体和组织化学基础上发展起来的一种新的免疫测定技术，是在不影响酶活性和免疫球蛋白分子的反应条件下，使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体。酶标记抗体可直接或通过免疫桥与包被在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合，来检测病毒的存在。ELISA方法依据支持物的不同，可分为双抗体夹心法（DAS）-ELISA和硝酸纤维素膜（NCM）-ELISA。 （1）DAS-ELISA 这种方法是以聚苯乙烯塑料管或血凝滴定板为支持物，采用直接ELISA，基本步骤是先加入第一抗体，再依次加入病毒提取液、第二抗体、底物，所以叫做双抗体夹心。DAS-ELISA方法检测病毒，特异性强，非常适合于大规模的检测，该方法可检测出1～10ng/mL的抗原浓度，通过分光光度计可测定出病毒含量，对脱毒苗的确认极具应用价值。 （2）NCM-ELISA 又称Dot-ELISA，该种方法是以NCM为固相载体，通常采用间接ELISA，基本步骤是首先将待测样品点在NCM膜上，然后依次加入病毒第一抗体，第二抗体，底物。此法与常规法相比有很多优点，NCM对蛋白质有较高的亲和力，提供蛋白较大的结合表面，使检测的灵敏度提高，而且反应产生鲜明的色斑，形成强烈的对比；NCM法测定所需的最低病毒量低于常规ELISA。

3. 免疫电镜法（ISEM） 植物病毒免疫电镜检测是利用植物病毒特异性的抗体，使它诱捕或包被病毒的粒体，产生免疫吸附反应。将此程序制备的载网，放到电子显微镜下观察。此法鉴定植物脱毒苗病毒能够保证核心种苗的质量，而且快速准确，反应灵敏。但是电镜方法的缺点是受条件限制，操作要求严格，不适于普及应用。此外，Ig指示试纸法，病毒细菌协同凝集法(VB)，也可以用来检测病毒。

4.反转录聚合酶链反应（RT-PCR） RT-PCR的基本原理是以所需检测的病毒RNA为模板，反转录合成cDNA，从而使极微量的病毒核酸扩增上万倍，以便于分析检测。RT-PCR的基本步骤是：首先提取病毒RNA，根据病毒基因序列设计合成引物，反转录合成cDNA，然后进行cDNA扩增。取出扩增产物，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。RT-PCR技术与免疫学方法相比较不需要制备抗体，而且检测所需的病毒量少，具有灵敏、快速、特异性强等优点。 （1）简并引物PCR技术 根据不同病毒间的同源保守序列，设计简并性引物，而使一次实验能够检测多种病毒。 （2）免疫捕捉PCR技术 在进行RT-PCR扩增反应前，利用病毒专化性抗体与病毒抗原相结合的原理，将目标病毒固定在微管或微板等固相上，经洗脱处理后富集病毒，再进行RT—PCR反应这样不仅避免了常规RT-PCR的RNA样品制备的损失和破坏，而且捕捉RNA的效率达96%以上。 （3）多重PCR技术 多重PCR就是在一个单一反应中扩增多个序列，能够节省时间与精力。RT-PCR技术与免疫学方法相比较不需要制备抗体，而且检测所需的病毒量少，具有灵敏、快速、特异性强等优点，是一种比较有前途的检测方法。

5.核酸斑点杂交技术（NASH） NASH是根据互补的核酸单链可以相互结合的原理，将一段核酸单链以某种方式加以标记，制成探针，与互补的待测病原核酸杂交，带探针的杂交物指示病原的存在。此法存在的缺点是在检测大量样品时，探针的分离比较困难〔33〕。

此外，PCR微量板杂交法〔17〕，蛋白质电泳法〔27〕也可以用来检测植物病毒。

8.植物组织培养如何克服玻璃化和褐变现象？

玻璃化指在组织培养过程中，有些植物的嫩茎、叶片往往会呈现半透明状，水浸状的现象，又称过度水化。玻璃苗的分化能力低下，难以增殖生根成苗，这是一种生理失调症。目前已报道出现玻璃化苗的植物已达7O多种。

随着玻璃化产生机理研究的深入，某些植物的玻璃化已得到了有效的控制。主要措施有：(1)选择不易玻璃化的基因型及部位做外植体；(2)采取改善氧气供应状况和通气条件，

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