MTT法原理步骤(3)

五、计算抑制率

[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.

六、注意事项

1、MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内，超出这个范围就不是直线关系。（阴性组在0.8-1.2，加药组在0-0.7）。

2、MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。我自己操作一般是每次配制15ml,过滤后4℃避光保存，在两周内用完。

3、MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套，配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者不放心的时候可以关闭超净台上的日光灯来避光，这样比较好。

4、选择适当得细胞接种浓度，每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。每孔1000-10000个，但是也要看细胞种类和状态。我做的是药物抑制肿瘤细胞生长和增殖，铺过2000至8000个每孔。2000太低，8000过高，对于阴性组高于5000个吸光值就很大，大于1.5。所以对于我自己的A549实验一般选用3000-5000。一般每孔4000个细胞为宜

5、避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

6、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

7、用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO。加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

8、 MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。

9、铺板时要保证每孔铺的细胞数目均匀一致，一般每加几孔就混匀一下。我一般是加完一排复孔就混匀一次。

10、实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

11、贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入0.5%MTT，量为20ul/孔。

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