MTT法原理步骤(2)

每孔加150ul DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。

4、比色：选择490nm（570nm）波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

（二）药物MTT法实验步骤

1、贴壁细胞

（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100µl,铺板使待测细胞调密度至103-104cell/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

（2）5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药，一般5-7个梯度，每孔100µl，设3-5个复孔，建议设5个，否则难以反应真实情况。

（3）5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

（4）每孔加入20µlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

（5）终止培养，小心吸去孔内培养液。

（6）每孔加入150µl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

（7）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）

2、悬浮细胞

（1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序

①补足的1640（无血清）培养基40μl ；

②加Actinomycin D（有毒性）10µl用培养液稀释 (储存液100 g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；

③需检测物10µl；④ 细胞悬液50µl（即5×104cell/孔），共100µl加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100mL 1640）。

（2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

（3）每孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

（4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

（5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

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