有机纳米材料在植物核酸递送中的研究进展(2)

　　除了利用天然高分子材料制备纳米基因载体之外，用人工合成的高分子材料制备纳米基因载体更具优势，合成和制备相对容易、经济，并且能够规模化生产。目前在植物基因转化中使用较多的由合成高分子材料制备的纳米载体包括聚乙烯亚胺（polyethylenimine，简称PEI）、多聚赖氨酸（poly-L-lyine，简称PLL）和树枝状聚合物。

　　2.1聚乙烯亚胺

　　聚乙烯亚胺是一种常用的阳离子聚合物，是动物细胞转基因中常用的体外或体内非病毒基因载体，主要以分支状或线状结构形式存在[20]。分支状聚乙烯亚胺含有伯胺、仲胺、叔胺，线状聚乙烯亚胺主要含有仲胺。这些氨基基团使分支状聚乙烯亚胺在较宽pH值范围内具有缓冲能力，即所谓的“质子海绵效应”，PEI/DNA复合物被细胞内吞后，引起外源质子内流，随后水分大量涌入导致内吞囊泡裂解、释放出的PEI/DNA复合物穿过核膜进入细胞核，通过这个过程完成基因转染[21-22]。由于PEI本身对动物细胞有一定的毒害作用，最近主要通过使用交联低分子量PEI或者将低分子量PEI和生物可分解的阴离子基团结合起来的方法来减少PEI载体对细胞的毒性，提高转染率[23]。在用于植物基因转染方面，Ying等以PEI（分子量25000）为载体介导含有绿色荧光蛋白的质粒在拟南芥原生质体中瞬间表达，转化率达到65%[24]。但PEI是否能进入有壁的植物细胞以及进入植物原生质体的机制尚有待进一步研究。

　　2.2多聚赖氨酸

　　多聚赖氨酸是一种以赖氨酸分子为重复单元的线状多肽结构，它最大的优点是易于对其结构进行修饰，因此常被用作修饰物结合到其他纳米材料的表面[25]。在生理条件下，多聚赖氨酸中的氨基被质子化，能与DNA通过静电作用结合，多聚赖氨酸与DNA能以不同的比例相结合，相应形成从50nm到700nm不同尺寸的微粒。由于多聚赖氨酸缺少等电点处于5～7之间的氨基基团，利用多聚赖氨酸作为基因载体时，须要额外提供辅助因子如加入融合肽或氯喹，以促使溶酶体或内吞体裂解。在植物中尚未见将多聚赖氨酸单独用作基因载体的报道，多是将其修饰在其他纳米材料表面用于结合质粒DNA[19，26]。

　　2.3树枝状聚合物

　　树枝状聚合物指的是一类以内核分子为中心，延伸出许多具有树枝状高度分枝结构的球形分子，常用的包括聚乙二胺、聚乙烯亚胺和聚酰胺树枝状聚合物[27]。其中，聚酰胺树枝状聚合物（polyamidoaminedendrimers，简称PAMAM）由于容易合成，也容易得到市售产品，成为一类广泛使用的基因运送聚合物载体。PAMAM的基本特点是分散指数较低，容易形成球形，不饱和双键数量多，表面功能特性易于控制等。树枝状聚合物通常是通过分支末端带正电荷的基团和DNA带负电荷的磷酸基团之间的静电作用相互结合，形成直径约为50nm的DNA-树枝状多聚复合物，能够保护DNA免受核酸酶的降解作用。在植物转基因研究中，Pasupathy等曾使用PAMAM将绿色荧光蛋白的质粒导入草坪草的愈伤组织细胞中，转化率可以达到48.5%[28]。

　　3高分子纳米载体的入胞机制

　　制备的纳米材料与基因耦合构建成的转基因载体，能否顺利穿过细胞壁进入植物细胞，是能否在植物转基因工程中应用的关键。而纳米载体的入胞机制和效率，受到纳米材料尺寸、表面理化性质、植物细胞壁特征、共孵育环境条件等诸多因素的影响。目前，已经成功将外源基因导入植物细胞的有机纳米载体有壳聚糖、淀粉纳米颗粒、细胞穿膜肽、聚乙烯亚胺等，揭示的纳米载体携带外源基因进入植物细胞的机制见图1。

　　首先，DNA或RNA等外源分子可以通过疏水作用、静电吸附作用或共价键结合等结合在纳米颗粒的表面或者封装在纳米颗粒的内部，形成装载有外源基因的纳米颗粒耦合物。载有外源基因的纳米颗粒耦合物可以通过2条途径将外源基因送进植物细胞并得到表达。一类是利用物理力或场对细胞施加的主动影响，如电激、超声波、基因枪、外加磁场或低能重离子束场，在细胞上同时形成一些可逆的瞬间通道，外源基因被直接送入到细胞质或细胞核内[29]；另一类是利用载有外源基因的纳米颗粒耦合物通过静电吸附等作用附着在植物组织或细胞的周围，然后经胞间连丝等细胞壁上的孔隙通过细胞壁，或者利用修饰过的工程纳米颗粒同细胞壁上受体的相互作用来扩大细胞壁的孔径以提高纳米颗粒的摄入[16]。穿过细胞壁后，大多数纳米颗粒耦合物载体通过细胞膜的内吞作用进入细胞质，有的可能通过细胞膜上的转运载体蛋白或者离子通道转运进入细胞质。Ghosh等认为，纳米载体携带的基因，进入到细胞以后，在细胞内源因素（如pH值刺激）和外源因素（如光刺激）的激发下释放出纳米载体所携带的遗传物质。显然内源的激发基因释放机制是按照生物学的方式运作的，而外源的激发基因释放机制则提供一种可以通过时间和空间控制释放基因的方法[30]。

　　其次，DNA导入细胞核并整合到植物基因组中發挥功能。一般来说，分子都是通过核孔复合物进入细胞核的。对于DNA是单独进入细胞核还是与纳米载体整合后一起进入细胞核仍无定论，目前主要有2种理论。一种是纳米载体在内涵体或细胞质中被溶解，然后释放DNA转运进核，同植物细胞的基因组发生非同源重组，从而整合到植物基因组上得以稳定表达；另一种是携带DNA的纳米载体直接到达细胞核表面，然后DNA转运进核，并离开基因载体还原成具有生物活性的DNA，最后经过转录、翻译步骤合成目标蛋白[31]。

　　4展望

　　虽然按照构成材料组成可以将纳米颗粒分为无机和有机2种，在纳米材料载体实际的制备和运用中，通常是充分利用各类材料的优势，使用的是复合型纳米材料。例如常在各类无机纳米颗粒和有机高分子材料的表面修饰上多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺等高分子聚合物，甚至是再连接上量子点荧光标记或者加上细胞穿膜肽等靶分子，使其成为一个“超级复合纳米载体”——可以大量装载DNA、RNA等外源基因，高效定向地进入有壁的植物细胞实现外源基因的稳定表达。

　　多基因轉化是近年来植物转基因研究的一个亮点，而纳米载体转化法容量大，一次可将多个不同的质粒导入细胞内，并可在细胞内源因素和外源因素的作用下实现基因的可控释放，这些特点为植物基因功能的研究提供了一条新的途径。

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