有机纳米材料在植物核酸递送中的研究进展

　　摘要：将外源遗传物质导入植物细胞是植物生物技术研究中一项非常重要的技术，对农林业的发展有十分重要的意义，目前常用的植物转基因方法主要包括农杆菌转染法和基因枪法，随着纳米生物技术的发展，基于纳米材料为载体的植物转基因技术为植物遗传转化提供了新途径。本文综述了近年来有机纳米材料作为外源基因载体的特点、携带基因的能力、进入受体植物细胞的机制，并展望了有机高分子纳米载体在植物遗传转化中的应用，以期促进植物转基因技术的发展。

　　关键词：有机纳米材料；载体；核酸递送；壳聚糖；聚乙烯亚胺；多聚赖氨酸；树枝状聚合物

　　中图分类号：Q785文献标志码：A

　　文章编号：1002-1302（2017）22-0001-04

　　自1983年首次研究获得转基因烟草以来，植物转基因技术迅速发展，至2015年全球转基因作物的种植面积已达到1.797亿hm2。植物基因传递系统——将外源基因导入植物细胞的方法，是植物生物技术中一个最基本的技术。目前可以使用不同的方法将外源基因导入植物基因组中[3]。根据转化过程中是否使用载体介导，通常可以分为载体介导转化和直接遗传转化。在常用的载体介导转基因方法中，农杆菌介导是最广泛使用的转化手段；基因枪法是另一种常用的转基因手段，但是转化率较低、会产生大量嵌合体等问题是限制其使用的主要瓶颈。将植物细胞酶解去壁后获得原生质体再进行遗传转化，也是一类常用的转基因方法，但原生质体再生完整植株的难度较大、稳定性差的特点限制了这种方法在植物转基因中的广泛应用。针对上述植物转基因技术的局限，研发新的转基因方法和挖掘新的基因载体成为现代基因工程研究中的热点，业界期待着植物转基因新理论和新技术的突破，来促进植物转基因技术及其相关产业的发展。相对于源自病毒基因改造的遗传转化载体，基于纳米材料构建的载体具有制备容易、稳定性好、容易修饰、生物和环境安全性高等优点，因此纳米生物技术已成为划时代、跨学科的研究重点[4]。

　　根据纳米材料的组成，可分为无机纳米材料和有机高分子纳米材料，其中无机纳米材料用作植物转基因载体开展得较早，已有较多介绍。本文重点介绍有机纳米材料载体转基因技术的特点，并结合其在植物基因转化研究中的应用实例阐述这些方法的优点及存在的问题，详见表1。

　　1天然高分子纳米基因载体

　　1.1壳聚糖（chitosan，简称CS）

　　壳聚糖是广泛分布于甲壳类动物、昆虫和真菌细胞壁中的甲壳质在碱作用下脱乙酰化后得到的氨基多糖。Mulligan等首次利用壳聚糖为载体把外源DNA运输到哺乳动物细胞内，壳聚糖纳米载体由于来源天然、生物相容性好、可生物降解、可溶性强、无毒等特点，在生物医学上成为研究较多的天然高分子纳米基因载体系统[5-6]。

　　在植物转基因研究中，壳聚糖纳米载体的研究处于刚刚起步阶段。宋瑜等用壳聚糖为基因载体，制备了CS/DNA纳米复合物，直接将绿色荧光蛋白基因（简称GFP）转化到拟南芥原生质体中，但转化效率很低，而且对细胞有毒害作用[7]。王凤华等用交联法制备了壳聚糖纳米颗粒，通过静电作用吸附质粒DNA后，用基因枪法转化洋葱细胞，观察到有8%的细胞转化成功并表达目的基因[8]。Wang等通过静电吸附作用将CS/DNA纳米颗粒和硒化镉量子点（简称QDs）纳米颗粒连接起来，制备了CS/DNA—QDs复合纳米颗粒[9]。这种复合纳米颗粒对外源基因具有显著的酶切保护作用，并实现了GFP转载基因在麻疯树细胞内的表达。

　　从上述研究结果来看，壳聚糖纳米载体在植物细胞中的转化效率较低，对去壁的植物细胞原生质体有一定的毒性。但壳聚糖作为一类天然的高分子聚合物，可以对其进行化学和生物学的修饰来提高它在生理溶液中的稳定性、基因转移的特异性和在细胞内逃逸的能力。壳聚糖被开发成为一类环境友好的新型植物基因工程介导物质具有较好的前景。

　　1.2淀粉

　　淀粉是一类价格便宜、产量丰富、可再生的天然材料，通过物理、化学或者酶解的方法可以大大改善它的性能。在医药领域，淀粉常被用作填充剂，由于它具有生物相容性和生物可降解性，也常被用作药物和基因载体系统。Xiao等利用反向微乳液法合成多聚赖氨酸-淀粉纳米颗粒，在乳腺癌细胞中成功地进行了转化试验[10]。Liu等研究表明，在利用超声波介导的基因转移试验中发现，多聚赖氨酸淀粉纳米基因载体能够保护DNA，使其不受超声波的影响，而裸露的DNA则会被超声波破坏[11]。Liu等在超声波的作用下，用多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒将含有绿色荧光蛋白的质粒转入到盾叶薯蓣和水稻悬浮细胞中并实现了表达[12]。Wang等利用反向微乳液法合成磁性淀粉纳米颗粒，包封多聚赖氨酸，连接异硫氰酸荧光素（简称FITC），得到了既有荧光标记、又有磁性的双功能淀粉纳米颗粒，有望成为一种新型的基因载体[13]。

　　1.3细胞穿膜肽（cell-penetratingpeptides，简称CPPs）

　　细胞穿膜肽是一大类由10～30个氨基酸组成的短肽，具有很强的跨膜转运能力，能够携带多种活性物质进入细胞，而且可以导入几乎所有的细胞中[14]。由于细胞穿膜肽具有很强的跨膜转运能力，对细胞膜不会产生永久性损伤，在一定浓度范围内对宿主细胞无毒害作用。因此，细胞穿膜肽作为一种新型的药物输送工具和基因治疗的载体引起人们极大的关注和广泛的使用[15]。

　　在植物基因运载方面，近几年Lakshmanan等利用细胞穿膜肽载体分别将质粒DNA、dsRNA、dsDNA用注射渗透法转化烟草和拟南芥的叶片，可以实现外源基因在植物细胞内的瞬间表达或者快速、高效诱导基因沉默[16-18]。最近，Chuah等用含有线粒体定位肽的阳离子聚合物结合质粒DNA，单独或者同细胞穿膜肽再结合，用注射渗透法转化拟南芥叶片，孵育12h后，報告基因能够在拟南芥叶片表皮细胞的线粒体中表达[19]。从已有的研究报道可见，细胞穿膜肽作为基因载体可将质粒DNA、dsRNA、dsDNA转运进入完整的植物细胞或者某个特定的细胞器中并表达。未来经过优化和提高其转化率后，细胞穿膜肽这类信号肽类的载体有望成为又一类新兴的植物转基因载体，但其入胞机制特别是如何穿过植物细胞壁还值得进一步研究。

　　2合成的高分子纳米基因载体

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