菊粉酶酶源诱变菌株产酶发酵条件的优化(2)

　　1.2.5发酵时间对产菊粉酶的影响。以3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和0.5%（NH4）2HPO4为复合氮源，培养基初始pH值为6.0，30 ℃下分别发酵24、48、72、96、120 h，每隔24 h取样。将各处理的发酵液经8 000 r/min离心10 min后，收集上清液，测定酶活力。 
　　1.3发酵液中还原糖含量及菊粉酶的活力测定 
　　采用3，5-二硝基水杨酸法[3]测定发酵液中还原糖的含量，在540 nm波长处测定吸光度值，根据葡萄糖的标准曲线，求得还原糖的含量；酶活力定义为在规定反应条件下每分钟转化底物生成1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位（U/mL），按照Pessoni等人报道的研究方法测定菊粉酶活力[4]。 
　　2结果与分析 
　　2.1不同碳源对产菊粉酶的影响 
　　试验结果表明，以2%菊芋汁为碳源时酶活力最高，为12.33 U/mL；菊粉次之，为10.18 U/mL；葡萄糖、果糖为碳源时酶活力较低，均在2.5 U/mL以下。进一步分析不同浓度菊芋汁为碳源对产菊粉酶的影响，发现菊芋汁浓度为3%时，菊粉酶活力最高，为11.18 U/mL。 
　　2.2不同氮源对产菊粉酶的影响 
　　研究结果表明，复杂有机氮源比简单无机氮源有利于菊粉酶的产生，且最适有机氮源为牛肉膏，无机氮源为（NH4）2HPO4， 2种氮源所得到的菊粉酶活力分别为14.14 、8.64 U/mL。由表1可以看出，复合氮源比单纯有机或无机氮源更有利于菊粉酶的产生，且当牛肉膏和（NH4）2HPO4的质量浓度分别为2%和0.5%时，菊粉酶活力最高，为19.98 U/mL。  　　2.3培养基初始pH值对产菊粉酶的影响 
　　检测不同初始pH值对黑曲霉A24诱变菌株产菊粉酶的影响，结果如图1所示。可以看出，在初始pH值为3~6的范围内，随着pH值升高，菊粉酶酶活增强，pH值为6.0时产菊粉酶酶活最高，达到28.83 U/mL。此后随着pH值升高，菊粉酶酶活明显下降。 
　　2.4发酵温度对产菊粉酶的影响 
　　试验结果表明，在24~30 ℃范围内，随着培养温度升高菊粉酶酶活增强，30 ℃时产菊粉酶酶活最高，为32.51 U/mL。此后，随着温度升高，菊粉酶酶活明显下降，说明菊粉酶对温度比较敏感。因此，30 ℃是黑曲霉A24诱变菌株产菊粉酶的最适温度（图2）。 
　　2.5发酵时间对产菊粉酶的影响 
　　由图3可以看出，随发酵时间的增加，黑曲霉A24诱变菌株产菊粉酶活力增强，在培养72 h后产菊粉酶酶活最高，为35.21 U/mL。此后，随着发酵时间延长，菊粉酶酶活有下降趋势。 
　　3结论与讨论 
　　近年来，利用微生物产菊粉酶已有不少报道，包括真菌中的黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium sp.）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）以及细菌中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和假单孢菌（Pseudononas sp.）等[5]，其中黑曲霉由于特性稳定、易于培养而受到格外关注，并被普遍用来发酵生产菊粉酶。王静等[6]对一株黑曲霉JNSP5-06产菊粉酶的发酵条件进行了优化，得到最佳优化条件：2%菊粉，2%酵母膏和0.5%NH2PO4，初始pH值6.5，30 ℃培养96 h，优化后的最佳产菊粉酶活力达到29.73 U/mL；唐艳斌等[7]曾报道黑曲霉菌株SYS-1在菊粉2%、（NH4）2HPO4 2%、初始pH值6.0、30 ℃培养96 h的发酵条件下产菊粉酶酶活最高，达到59.25 U/mL。而该试验确定的黑曲霉A24菌株产菊粉酶的最适发酵条件为：菊芋汁3%、牛肉膏2%、（NH4）2HPO4 0.5%、初始pH值6.0，30 ℃培养72 h。在此条件下，黑曲霉A24诱变菌株发酵液中菊粉酶活力最高，为35.21 U/mL。试验所确定的最适氮源与王静等[6]的结果不一致，培养时间比上述报道缩短了24 h，可能是因为不同菌株间存在一定差异所致，但该试验结果明显能减少成本，在生产中的应用潜力更大。 

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