2.1氮素吸收相关基因
虽然高等植物可以利用有机态的氮,但根系主要吸收的氮源还是NO3- 和NH4+。近年来,人们从分子水平上对硝态氮的吸收系统进行了大量研究。已发现2 种基因NRT1 和NRT2 与硝态氮转运系统(HATS 和LATS)有关。目前已从多种作物中克隆了硝态氮低亲和系统的基因。越来越多的证据表明,铵高亲和转运体应是AMT1 家族的成员,原因是AMT 蛋白在植物根系吸收土壤氮素中起主要作用。如在拟南芥根系中,AtAMT1;1、AtAMT1;2和AtAMT1;3 基因都有充分的表达,而且通过调节这些基因,改变了根系对铵的吸收活力。植物中第1个被发现的AMT1 基因是拟南芥中的AtAMT1;3,用核DNA 消减法也从酵母铵运转体缺陷型突变体中克隆了此基因。AtAMT2基因在拟南芥的所有器官中都有表达,受氮素的调节,在根系的表达部分受到高浓度硝酸铵的抑制。在地上部分,AtAMT2的表达基本不受根部氮素状态的调节;所以在植物体的所有细胞中,AtAMT2在铵从质外体到共质体的运输中可能有重要作用。
2.2氮素利用基因
谷氨酰胺合成酶GS是参与植物氮代谢的关键酶。高等植物中编码GS的基因的表达是一个十分复杂的过程,而且因植物种属的不同而呈差异表达。植物发育进程以及光照、氮源的形式、水分、NaCl等外界因子均影响GS基因的表达。作物在吸收氮素的过程中具备1套酶系统,能有效地将氨转化为氨基酸,进而同化为蛋白质。氨基酸的合成是通过GS和谷氨酸合成酶(GOGAT)的偶联作用,同时有各种氨基转移酶参加完成。GS、GOGAT 在植物叶片、根瘤以及根中均有分布[3],但在不同器官中GS/ GOGAT 循环的作用不尽相同。在绿色组织中,GS/ GOGAT 循环的主要作用是同化光呼吸产生的NH4+ 以及硝酸盐在叶中还原产生的NH4+,在根瘤中则主要同化根瘤菌固氮 产生的NH4+,而在根中则是同化吸收到体内的NH4+ 以及硝酸盐被吸收后在根中还原产生的NH4+。高等植物体内95%以上的NH4+通过GS/ GOGAT循环同化合成氨基酸,从而实现对所吸收的氮素的利用。
综上所述,在目前已知的氮素吸收系统相关基因主要有4类:铵吸收基因AMT、硝吸收基因NRT、GS基因和GO GAT基因。
3荧光定量PCR技术及其应用
3.1荧光定量PCR技术优点
传统PCR 可对特定核苷酸片段进行指数级扩增。在扩增反应结束之后,可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析,也可以通过对光密度扫描来进行半定量分析。但是无论定性还是半定量分析,分析的都是PCR 终产物,不能确保PCR 产物信号与初始模板的拷贝数成比例。由于吸收基因表达量很低,很难进行精确定量,实时荧光定量PCR技术实现了对低拷贝基因表达量的快速、准确定量。
实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)[4]是在传统PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术,它有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,测得未经PCR信号放大之前的起始模板量。其反应体系中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR 反应产物不断累加,荧光信号强度也等比例增加。这样就可以根据指数扩增期的产物荧光强度来推算初始模板的量。与传统PCR 方法相比,它具有定量准确可靠、灵敏度高、重复性好,而且操作简便、安全、快速等特点。实时荧光定量PCR从原理上有两大类荧光模式:一是荧光杂交探针,二是双链DNA内插染料。前一种方法特异性好,除需要合成序列特异引物外,还需要合成高成本的荧光探针,成本较高;后一种方法经济,使用方便,只需合成序列特异引物,没有序列特异性,可以用于不同的模板。但正是由于荧光染料可以和任何的双链DNA结合,因此DNA引物二聚体或其他非特异扩增产物可以对结果产生干扰。通过摸索优化反应条件和荧光捕捉点、建立简单实用的标准曲线、用溶解曲线和凝胶电泳证实等手段,解决或弥补DNA 结合染色的不足,成功建成了可检测DNA和mRNA的SYBRGreen实时荧光定量PCR 技术平台。实时荧光定量PCR技术已经成为实验室一种特异性、高敏感性的定量检测基因表达的有效方法。
百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说理学类实时荧光定量PCR技术在水稻氮素基因表达中的应用研究与展望(2)在线全文阅读。
