2.3基于同源重组的定点打靶载体
除同源重组技术外,无论采用何种技术导入外源基因,外源基因均是随机插入受体细胞基因组的任何位置。利用同源重组原理的基因打靶技术的出现,能够将目的基因定位整合于乳蛋白(或其他合适的)基因座,充分利用天然乳蛋白固有的高效表达调控机制,克服拷贝数依赖性和随机整合的“位点效应”,保证目的基因在乳腺中的特异性表达,并可能取得与乳蛋白同步的表达水平。如将携带启动子的外源基因敲入一些开放的活跃转录的位点中(如HPRT位点)可以克服“位点效应”的影响[6]。
乳腺生物反应器的基本原理是用乳蛋白基因启动子和调控区指导外源基因在乳腺中特异性表达。常用的乳蛋白有乳清酸性蛋白(Whey Acidic Protein,WAP)、α-乳蛋白、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)、β-酪蛋白和αsl-酪蛋白等。其中,BLG是牛、羊等反刍动物乳汁中含量最高的乳清蛋白,说明驱动其表达的启动子效率较高。在目前有关乳腺生物反应器的研究报道中,以BLG基因调控序列指导人α-1-抗胰蛋白酶基因在绵羊乳腺中的表达水平最高,达到35g/L。此外,BLG基因调控区相对较短,大部分乳腺特异性表达调控元件位于-406bp范围内[7],易于进行分子克隆。因此,BLG基因调控序列是构建反刍动物乳腺特异表达载体的首选调控序列。
3动物乳腺生物反应器的发展现状
全球已经有几十家大公司在进行动物乳腺生物反应器的产业化开发。其中英国的PPL公司、荷兰的Pharming以及美国最大的生物技术公司Genzyme Transgenics Corporation是3个最为出色的公司。他们在药物开发、市场和产业化方面投入大量资金。到目前为止,已有2种药物完成临床试验(其中重组人抗凝血酶Ⅲ(ATryn®)已于2006年批准上市),5种进入临床Ⅲ期试验,37种进入Ⅱ期临床研究阶段。现在,许多国家正在进行相应的工作,如美国、英国、俄罗斯、瑞典、荷兰、澳大利亚、加拿大、法国等。在国内,早在1983年,施履吉院士就提出利用转基因动物乳腺生产重组蛋白质的构想。与国外相比,中国在转基因动物乳腺生物反应器研究方面比较落后。但是,国家“863”计划已经将乳腺生物反应器的研究作为重大项目进行资助,将使中国转基因动物乳腺生物反应器的研究和开发进入一个蓬勃发展的新时期,目前已经取得一些重要成果[8-10]。
尽管动物乳腺生物反应器的研究和发展很快,但仍面临一些问题,诸如生产周期长、基因整合效率不高等。此外,转基因动物死亡率较高,常出现不育导致转基因动物续代难,从而无法大规模生产。纵观全球,外源基因能够在大动物乳汁中高效表达的成功实例很少,真正达到产业化生产标准的更是屈指可数。
动物乳腺生物反应器研究的现状,特别是奶用家畜乳腺生物反应器的研究现状,可以用“难度大、效率低、时间长和费用高”来形容。其中,生产转基因动物效率低和外源基因表达受“位置效应”的瓶颈影响最为严重,是构建动物乳腺生物反应器必须克服的最大难题。克隆技术可以将体外培养的、基因定点修饰后的动物体细胞(或者干细胞)转变成动物个体,从而可以很好地解决动物转基因表达效率低的问题。因此,采用以体细胞克隆技术和转基因干细胞技术为核心的各种技术平台,可能是未来生产动物乳腺生物反应器动物的希望和必然趋势。目前,在这方面已有成功的报道[10,11]。21世纪,转基因干细胞技术和动物克隆技术的有机结合,必将实现种质创新和技术突破。乳腺生物反应器的产品将大量进入市场,为人类的生存与健康发展作出贡献。
4参考文献
[1] 袁建民,胡建宏,李青旺,等.动物乳腺生物反应器研究进展[J].中国农学通报,2006(22):20-24.
[2] MARTIN D I,FIERING S,GROUDINE M.Regulation of beta-globin gene expression:strainghtening out the locus[J].Curr Opin Genet Dev,1996(6):488-495.
[3] MURRAY A W,SZOSTAK J W.Construction of artificial chromosomes in yeast[J].Nature,1983(305):189-193.
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