各种生化指标测定方法(2)

2.3.5.5过氧化物酶（POD）活性的测定

参照林植芳（1988）的方法。取1g样品，加入0.2 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.15 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0），用液氮磨碎，提取液于4℃下15,000 rpm离心20min，上清液用于酶活性的测定。。3 mL反应体系中含有0.2%愈创木酚0.9 mL，0.1%的过氧化氢（H2O2）2.0 mL和0.1酶液。加入酶液后，测定OD470值的变化，以每分钟△OD470变化0.01表示一个酶活性单位。 POD总活性(μ·g-1·min-1)=△A×V1/（V2×W×T×0.001） △A ：每分钟吸光度值的变化； V1：提取酶液总体积，mL； V2：测定用酶液体积，mL； W：样品鲜重。 T：反应时间，min。

2.3.5.6过氧化氢酶（CAT）活性测定

参照Chance等（1995）的方法，略加改进。样品提取同POD方法。3毫升反应体系含有1mL 0.2%过氧化氢、1.9mL双蒸水。测定3min内波长240nm处的变化，以每克鲜样每分钟吸光值变化0.01为一个酶活力单位。 CAT总活性(μ·g-1·min-1)=△A×V1/（V2×W×T×0.001） △A ：每分钟吸光度值的变化； V1：提取酶液总体积，mL； V2：测定用酶液体积，mL； W：样品鲜重； T：反应时间，min。

2.3.5.7抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定

参照Nakano和Asada（1981）的方法，并加以改进。称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4 ℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在

20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。

APX总活性(uM·g-1·min-1) = △OD×Vr/ (A×d×Vt×W×△t) △OD：反应时间内吸光度的变化； △t：反应时间，min； Vr：提取液体积，mL； A：消光系数，2.8mM-﹒cm-1；

1

d：比色杯厚度，1cm； Vt：测定液体积，mL； W：样品鲜重，g。

2.3.6 菜薹内源激素（GA3,IAA,ABA，ZT）含量的测定

采用吴颂如（1998）、钱利生（1996）、陈昆松等（2003）的方法，并略加修改用高效液相色谱法测定。具体流程如图1。 采用美国安捷伦科技有限公司Agilent1100高效液相色谱仪，测定条件：色谱柱为C18柱（250mm×4.6mm,5u,Hypersil）,流动相为甲醇：乙腈：磷酸缓冲液（0.02mol/L,Ph3.5）=15：15：70，流速为1mL/min,柱温35℃，（GA3、IAA、ABA）检测波长为210纳米，ZT检测波长为254纳米，进样量10uL，外标法测定。

菜薹混合样1g 6毫升80%预冷甲醇冰浴研磨，4℃浸提20小时 离心（12000rpm,4℃,10分钟） 残渣 合并上清液 3毫升80%甲醇浸提并离心两次 加PVPP0.2g（吸附色素），离心（12000rpm,4℃,10分钟） 上清液过C18小柱 甲醇液 真空干燥仪蒸干 pH3.0NA2HPO4-柠檬酸缓冲液1ml溶解,乙酸乙酯等体积萃取3次 3ml酯相（上层） 1ml水相（下层） 真空干燥仪蒸干 真空干燥仪蒸干 1ml色谱甲醇溶解 pH8.0磷酸-柠檬酸缓冲液1ml溶解，85%正丁醇等体积萃取30.22um有机系微孔滤膜过滤 酯相3ml(上层) 真空干燥仪蒸干 1ml色谱甲醇溶解 HPLC测定样品 HPLC测定样品 0.22um有机系微孔滤膜过滤 测GA3、IAA、ABA 测ZT 2.3.7 统计分析方法

数据统计分析使用EXCEL2003和SPSS17.0统计软件。

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