细胞工程要点复习笔记

细胞融合（cell fusion)，

- 指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的 过程。

- 自然过程：受精

（四）细胞融合的意义

可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。

体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。 二 细胞融合的基本原理

显微镜下细胞融合过程

融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解 用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 Fusion protein 在细胞融合过程中的作用 三 细胞融合的常用方法 (一) 仙台病毒法

仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：

①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；

②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；

③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； ④融合成巨大细胞，仍需ATP 。

病毒促使细胞融合的主要步骤如下：

1. 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；

2. 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； 3. 两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 4. 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。 (二) 聚乙二醇（PEG）法 用法简单，融合效果稳定。 PEG的作用机理：

PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。

PEG诱导融合的特点：

融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。 (三) 电融合法

电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。

电融合法的优点：

融合率高、重复性强、对细胞伤害小；

装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程； 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。

电融合的基本过程：

细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其 分为以下几种类型：

异核细胞：非同源细胞的融合体。 同核细胞：两个相同细胞的融合体。

多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。

常用的杂种细胞筛选方法

基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 具有所需性状杂种细胞的筛选

单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。 二、杂交瘤技术的基本原理 （一）杂交瘤技术的理论基础

?? 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体； ?? 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；

?? 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备单克隆抗体（McAb）。

三、杂交瘤细胞的制备

（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基 .骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体

.选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） .胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-） HAT培养基

次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基喋呤（aminopterin， A） 胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， T）

四、单克隆抗体的应用

单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。

利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。

单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术。 单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不断发展。

动物细胞大规模培养的用途

- 蛋白质 蛋白质药物 蛋白质疫苗 诊断用蛋白质或抗体

- 病毒 疫苗生产 基因治疗

- 干细胞的大规模培养 体细胞的大规模培养: 组织工程，免疫治疗，肿瘤疫苗等等。。。。 4. 大规模细胞培养的方法 1） 贴壁培养

a. 转瓶或细胞工厂培养

b. 贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）如:Vero 细胞 - 微载体和多孔微球培养

- 提供充足的贴附面积、传氧条件好 - 避免了剪切力的损伤

- 适用于多种生物反应器进行大规模培 养

- 培养过程中需要血清

2）悬浮培养

- 操作简便，培养条件均一，容易扩大培养 - 细胞密度大，生产效率高 - 适用于生物反应器放大

- 是蛋白质药物生产的主流技术 5. 大规模细胞培养的模式

批式操作（batch culture)：细胞生长一定密度后，收获上清液或细胞 - 技术简单

- 原核细胞常用

- 常用于病毒疫苗制备

- 一般不用于真核细胞的蛋白质表达 - 蛋白表达量低 - 成本高

半连续式操作：每间隔一定时间取出部分培养物，补充新鲜培养基，继续培养。

灌流式操作(Perfusion culture)：培养过程中不断有培养液取出，同时不断补充新鲜培养基 - 细胞密度高，可达到1x10e8cell/ml

- 生物反应器利用率高，需要较小的生物反应器 - 产品在罐内停留时间缩短，可及时收获蛋白质 - 有利于产品质量的提高。 - 培养时间长，工艺复杂 - 污染风险大 - 容易堵塞

流加培养（fed-batch culture）：

* 培养物过程中定期加入营养及补充成分培养基

– 补加氨基酸，糖，谷氨酰胺，维生素，生长因子等

– 蛋白质产量高 – – – –

工艺稳定 条件易控

时间周期相对较短

是单克隆抗体和许多蛋白质药物的首选培养方法

6. 细胞培养的规模

bioreactor 30L-15000L 7. 生物反应器新发展：

single use bag bioreactor 配合Wave bioreactor - 一次性使用，防止污染 - 无需复杂的在线灭菌过程 - 建设成本低

8. 生物反应器的条件优化 1. 温度 2. pH， CO2 3. 渗透压 4. 氨, 谷氨酰胺 5. 糖，流加 6. 氧气，供养 7. 乳酸 8. 氨基酸及其他营养成分 9. 蛋白质药物生产过程

10.常用细胞

CHO细胞的优点

（1）既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；

（2）具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源基因的整合稳定；

（3）具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； （4）能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到25000L以上，可以大规模生产。 (5) 糖基化与人细胞相似。

鼠骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合后形成杂交瘤细胞 –它们是“专业”的分泌细胞，在培养上清中可产生高达5g/L的Ig， –容易转染，容易生长，

–无血清培养基中高密度悬浮培养。

–常用的细胞有NS0 、 Sp2/0、J558L和等。

干细胞

是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。 干细胞的特性： 1，形态和生化特征:

圆形、体积小、核质比例大，端粒酶活性高 2 ，干细胞的增殖特点

缓慢性：干细胞的增殖速度一般比较慢。而一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化。 自稳性：会自我更新维持自身数目的恒定。（self-maintenance） 干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂

3，干细胞的分化特点

1）. 多潜能性 2）. 去分化和转分化的能力

2）. 去分化和转分化的能力

（1）去分化 一种干细胞向其前体细胞的逆向转化的过程。

（2）转分化（transdifferentiation） 一种组织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种组织

类型细胞的过程。

4，特点

干细胞本身不是终末分化细胞； 干细胞能无限增殖分裂；

干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；

干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为干细胞或分化为特定细胞。

三，干细胞的分类 按分化潜能

全能干细胞 （Totipotent stem cell）

是指具有无限分化潜能,能分化成所有组织和器官的干细胞。换句话说,也就是具有形成完整个体分化潜能。

多能干细胞（pluripotent stem cell）具有分化出多种细胞组织的潜能。如造血干细胞、神经干细胞。

单能干细胞（monopotential cell）只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。 按发育状态(来源)

胚胎干细胞embryonic stem cell,ES细胞

指从着床前的内细胞团或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。

成体干细胞（Adult-derived Stem Cell ）

是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。

a取自终止妊娠的胎儿的性器官组织b取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞c通过体细胞核转移技术获得

过渡放大细胞

是介于干细胞和分化细胞之间的中间态细胞。它可以起到通过较少的干细胞产生较多的分化细胞的作用。

细胞工程

是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。它主要由两部分构成，其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。另一个则是下游工程，是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。

组织培养

首先将外植体分离出来，然后在无菌及适当条件下培养以诱导出愈伤组织，另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养，以避免代谢产物积累及水分散失等因素的影响。

细胞培养

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