质粒大量提取、纯化方法及相关溶剂的详细配方

PEG8000沉淀法大量制备和纯化质粒

1 质粒提取纯化步骤 1.1 质粒提取步骤

1) 在超净工作台上，将甘油管保种的质粒菌自然解冻后接种到含200 mL 液体LB（含100 μg/mL Kan）培养基的三角瓶中；

2) 置于恒温摇床中，37℃、180 rpm条件下振荡培养16个小时； 3) 用50 mL离心管在12,000 rpm、2 min条件下离心菌液，弃上清； 4）重复步骤3，将200 mL菌体合并到2个50 mL离心管中；

5) 菌泥重悬于3.6 mL 溶液I，加入400 μL新配的溶菌酶（10 mg/mL），涡旋震荡混匀，室温放置15-20 min，中间晃动2-3次；

6) 加入8 mL现配的溶液II，盖紧管盖后轻柔颠倒10次混匀至溶液呈透明粘稠状；

7) 加入4 mL预冷的溶液III，盖紧管盖后颠倒10次混匀至白色絮状沉淀呈均匀分散状；

8) 12,000 rpm离心10 min，用尼龙滤膜过滤将上清液转移至新的50 mL离心管中；

9) 加入0.6倍体积的异丙醇（9.6 mL），充分混匀后室温放置30 min； 10) 12,000 rpm离心5 min，弃上清，加入5 mL 70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm离心2 min；

11) 弃乙醇，晾干后加400 μL TE（pH 8.0）溶解核酸，转入10 mL离心管中，再加200 μL TE洗管，合并后共600 μL于4℃保存。（如果提取量较多，合并后TE应少于2.5 mL） 1.2 大提质粒的纯化

1) 在上述保存的每管中加等体积（600 μL）预冷的5 M LiCl，充分混匀后冰浴10 min，12,000 rpm离心10 min；

2) 取上清加等体积（1.2 mL）异丙醇，充分混匀后放置20 min，12,000 rpm离心10 min，弃上清；

3) 70%乙醇洗涤，12,000 rpm离心2 min弃上清，晾干后加700 μL TE 溶解于1.5 mL离心管中，加10 μL RNaseA（10 mg/mL），37 ℃消化30 min；

4) 加入0.5体积（350 μL）的含30 mM MgCl2的40% PEG8000，倒置混匀数次可观察到蛋清色絮状沉淀，静置20 min，12,000 rpm离心20 min，弃上清；

5) 70%乙醇洗涤，12000 rpm离心2 min弃上清，晾干后加700 μL TE 溶解于1.5 mL离心管中；

6) 加等体积（酚 350 μL，氯仿/异戊醇 350 μL）的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀5 min，12,000 rpm离心10 min，取上清再次用酚/氯仿/异戊醇抽提一次；

7) 取上清，加入等体积（650 μL）氯仿/异戊醇（24：1）混匀 5 min，12,000 rpm离心10 min；

8) 取上清600 μL于2 mL离心管中，加约1/10体积（60 μL）NaAc（3 M，pH 5.2），加2倍体积（1.2 mL）无水乙醇混匀，室温放置 20 min。12,000 rpm 离心10 min，弃上清；

9) 用70%乙醇清洗一遍，弃乙醇，晾干后加200 μL TE， -20 ℃保存备用； 10）用Nano drop核酸定量仪测定DNA浓度。 2 大量质粒提取试剂配方

表2.1 大量质粒提取试剂 Table 2.1 Plasmid extraction reagent

试剂 Solution I Solution II Solution III

1 M Tris-Cl（pH 8.0） 0.5 M EDTA（pH 8.0） STE

配方

50 mM Glucose、10 mM Tris-Cl pH 8.0、10 mM EDTA pH 8.0 0.2 M NaOH、1% SDS 现用现配

60 mL 5 M KAc、11.5 mL冰醋酸、28.5 mL H2O

12.1 g Tris碱，加水85 mL，用1 M HCl调pH至8.0，定容100 mL 18.6 g Na2·EDTA，加水85 mL，用0.1 M NaOH调pH至8.0，定容100 mL 10 mL 1 M Tris-Cl （pH 8.0）、2 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0）、5.884 g NaCl，定容至1 L，灭菌

TE

1 mL 1 M Tris-Cl（pH 8.0）、0.2 mL 0.5 M EDTA （pH 8.0）、98.8 mL ddH2O，灭菌

溶菌酶

表2.2 Solution I

试剂

Glucose（50 mM）

分子量：Glucose ：180.1572 Glucose·H2O：198.17 Tris（10 mM） 分子量：121.14 EDTA（10 mM） 分子量：374.26 总体积

配方 9.007 g 9.908 g 1.211 g

常用量 1.8014 g 1.9816 g 0.2422 g

10 mg/ mL，现用现配，溶于10 mM Tris-Cl（pH 8.0）

3.7426 g 1 L

0.7485 g 200 mL

用盐酸调节pH 至8.0后高压灭菌，4℃保存备用。

表2.3 Solution II（20×）

试剂 NaOH（0.2 M） SDS（1%） 总体积

20倍稀释后使用。

表2.4 Solution III

试剂 KAc 冰醋酸 水 总体积

表2.5 TE

试剂

Tris（1 mL 1 M Tris-Cl（pH 8.0））

EDTA 总体积

配方1 0.121 g 0.037426 g 100 mL

配方2 1.21 g 0.37426 g 1 L

配方1 29.44 g 11.5 mL 28.5 mL 100 mL

配方2 58.885 g 23 g 57 mL 200 mL

配方1 160 g 200 g 1 L

配方2 16 g 20 g 100 mL

用盐酸调节pH 至8.0后高压灭菌，4℃保存备用。

表2.6 溶菌酶

试剂

溶菌酶（10 mg/ mL） Tris（10 mM Tris-Cl）

总体积

配方1 1 g 0.121 g 100 mL

配方2 0.5 g 0.0605 g 50 mL

用盐酸调节pH 至8.0后，0.22 μm滤器过滤，4℃保存备用。

表2.7 PEG8000

试剂 PEG8000 MgCl2 总体积

用0.45 μm滤器过滤，4℃保存备用。

配方1 40 g 0.61 g 100 mL

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