门冬酰胺酶的制备与分析 - 图文

重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定

赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山

1 原理

本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。

目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。

本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。

2 实验材料

实验仪器见表1.1。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。

表1.1 实验仪器或装置

仪器名称 超净工作台 PCR扩增仪

型号 生产厂家

恒温培养箱 超低温冰箱 台式离心机 恒温摇床 涡轮振荡器 高压灭菌锅 蛋白电泳仪 核酸电泳仪 凝胶成像仪 紫外分光光度计 高效液相色谱仪 扫描型紫外分光光度

计

制冰机 超声清洗机

实验试剂和材料见表1.2。材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。

表1.2 试剂和材料

试剂或材料 E.coli 野生型菌株

pMD18-T pET-22b Nde Ⅰ Xho Ⅰ T4 DNA Ligase DNA纯化试剂盒 Ni-NTA树脂纯化试剂盒

材质或规格 CPU21009 50ng/μl 50ng/μl 10U/μl 10U/μl 350U/μl 离心柱型 离心柱型

来源 实验室储存 宝生物工程有限公司 宝生物工程有限公司 宝生物工程有限公司 宝生物工程有限公司 宝生物工程有限公司 天根生化科技（北京）有限公司 天根生化科技（北京）有限公司

质粒提取试剂盒 胶回收试剂盒

CaCl2 PBS NaCl Taq 酶 Mix (NH4)2S2O8 C2H6OS CH4O 冰乙酸 C2H6O 氨基丁三醇 考马斯亮蓝

SDS Nessler's 试剂

酵母粉 L-天冬酰胺 蛋白胨 甘氨酸 琼脂糖 葡萄糖 TEMED 溴酚蓝 IPTG 丙三醇

离心柱型 离心柱型 60mmol/L 50x 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 Reagent,ACS 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 食品级 优级纯 分析纯 优级纯 分析纯

天根生化科技（北京）有限公司 天根生化科技（北京）有限公司

实验室储存 实验室储存

美国Spectrum公司

英国OXOID公司

3 实验思路与步骤

本实验设计从大肠杆菌野生型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR扩增目的基因ansB，随后对PCR产物进行纯化。后分别构建重组克隆载体和表达载体，将克隆载体导入宿主中，筛选阳性克隆，再经双酶切和测序鉴定。后将构建的工程菌在合适的培养条件下发酵培养，利用IPTG诱导表达重组蛋白，对重组蛋白进行提取纯化。再由考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳测定分子量以及进行肽图分析和紫外扫描并与天然产品比较。同时，实验过程中以纳氏试剂法监控L-天冬酰胺酶酶活力，并计算回收率。

3.1 大肠杆菌L-天冬酰胺酶II基因ansB的获取 3.1.1 大肠杆菌ansB基因的选择与引物

从NCBI中查找获取大肠杆菌ansB的基因序列，其Gene ID为947454，基因长度为1047bp,序列如下：

1 atggagtttt tcaaaaagac ggcacttgcc gcactggtta tgggttttag tggtgcagca

61 ttggcattac ccaatatcac cattttagca accggcggga ccattgccgg tggtggtgac 121 tccgcaacca aatctaacta cacagtgggt aaagttggcg tagaaaatct ggttaatgcg 181 gtgccgcaac taaaagacat tgcgaacgtt aaaggcgagc aggtagtgaa tatcggctcc 241 caggacatga acgataatgt ctggctgaca ctggcgaaaa aaattaacac cgactgcgat 301 aagaccgacg gcttcgtcat tacccacggt accgacacga tggaagaaac tgcttacttc 361 ctcgacctga cggtgaaatg cgacaaaccg gtggtgatgg tcggcgcaat gcgtccgtcc 421 acgtctatga gcgcagacgg tccattcaac ctgtataacg cggtagtgac cgcagctgat 481 aaagcctccg ccaaccgtgg cgtgctggta gtgatgaatg acaccgtgct tgatggccgt

541 gacgtcacca aaaccaacac caccgacgta gcgaccttca agtctgttaa ctacggtcct 601 ctgggttaca ttcacaacgg taagattgac taccagcgta ccccggcacg taagcatacc 661 agcgacacgc cattcgatgt ctctaagctg aatgaactgc cgaaagtcgg cattgtttat 721 aactacgcta acgcatccga tcttccggct aaagcactgg tagatgcggg ctatgatggc 781 atcgttagcg ctggtgtggg taacggcaac ctgtataaat ctgtgttcga cacgctggcg 841 accgccgcga aaaccggtac tgcagtcgtg cgttcttccc gcgtaccgac gggcgctacc 901 actcaggatg ccgaagtgga tgatgcgaaa tacggcttcg tcgcctctgg cacgctgaac 961 ccgcaaaaag cgcgcgttct gctgcaactg gctctgacgc aaaccaaaga tccgcagcag 1021 atccagcaga tcttcaatca gtactaa

根据该基因序列，使用Primer 5.0 设计引物，并考虑到后续构建克隆载体和表达载体的需求，在引物序列中添加限制性酶切位点和保护序列，获得引物如下： 上游引物 P1 ：GTGCAGCACATATGTTACCCAATATCACCA 下游引物 P2 ：GCGCTCGAGTTAGTACTGATTGAAAGATCTG

上游引物P1 中包含一个Nde Ⅰ酶切位点，下游引物中包含一个Xho Ⅰ酶切位点。所设计引物交由南京华大基因科技有限公司负责合成。

3.1.2 大肠杆菌全基因组DNA的提取

使用大肠杆菌基因组DNA全提取试剂盒提取E.coli全基因组DNA，具体步骤如下：

(1)从实验室斜面保存的E.coli 野生型菌株CPU21009上，取接种环，挑单菌落，转移到50 mL的液体LB培养基，在温度37℃、 180 r／min发酵过夜。 (2)取菌液1 mL至1.5 mL的离心管管中，离心机参数调至12000离心2 min，离

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