ncRNA(非编码RNA)的知识(5)

的某些特征。使用抗N6,6-二甲基腺苷(位于16SrRNA3'末端24和25位)抗体，确定了修饰碱基区段(指16SrRNA3'端约25个碱基)位于30S亚基头和体之间。16SrRNA的第526位的m7G处于30S上1/3和下2/3交界处。16S、5S和23SrRNA的内部交联已被研究。证明在5SrRNA内G41和G72交联,这种交联属三级结构反应,利用此反应已经构建了一处改进的5SrRNA分子三维模型。此外，RNA-蛋白质交联研究也是测定亚基内rRNA分子空间排列的非常有用的方法。

现在一般认为,核糖体的基本功能依赖于其中的rRNA,核糖体蛋白质起着加强rRNA功能的作用。核糖体最初由rRNA构建,在进化过程中一些蛋白质加在其上。在体内外的实验均证明了缺乏某些蛋白质的核糖仍有生物活性;此外,rRNA基因(rDNA)突变及甲基化等均可引起对抗菌素(如红霉素、氯霉素)的抵抗。 核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3-5%。

rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome），如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。S为沉降系数（sedimentation coefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。5S含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸。而真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。

rRNA是单链，它包含不等量的A与U、G与C，但是有广泛的双链区域。在双链区，碱基因氢键相连，表现为发夹式螺旋。

rRNA在蛋白质合成中的功能尚未完全明了。但16 S的rRNA3’端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的，这可能有助于mRNA与核糖体的结合。核糖体RNA在各种生物中都有其特性，因此可以从不同生物的rRNA的对比中得出关于生物进化历程的结论。

rRNA为肽酰转移酶(peptidyl transferase)时，催化使肽键形成，不需要额外的能量。过去认为，大亚基的蛋白质具有酶的活性，促使肽键形成，故称为转肽酶。20世纪90年代初，H.F.Noller等证明大肠杆菌的23SrRNA能够催化肽键的形成，才证明核糖体是一种核酶，从而根本改变了传统的观点。核糖体催化肽键合成的是rRNA，蛋白质只是维持rRNA构象，起辅助的作用。与rRNA或核糖体亚基结合的蛋白质有二类：一类与rRNA或核糖体亚基紧密连接，需高浓度

盐和强解离剂(如3mol/LLiCl或4mol/L尿素)才能将其分离，这类蛋白质称为―真‖核糖体蛋白质(\或简称为核糖体蛋白质。如E.coli30S亚基上的21种蛋白质及50S亚基上的34种蛋白质(共54种，因为小亚基上的S20与大亚基上的L26是相同)，或者在真核细胞40S亚基上的30种蛋白质及60S亚基上的45-50种蛋白质(共约80种)，即属此类。而另一类蛋白质则为与有功能的核糖体亚基疏松缔合，能被0.5mol/L单价阳离子(如K+，NH4+)从亚基上洗脱，并对核糖体循环发挥调节作用的蛋白质，如起始因子(IF或eIF)和延长因子(EF)等,称为核糖体相关蛋白质(proteins associated with ribosome)，简称PAR。PAR不是构成核糖体的固有成分。 五、小核RNA（snRNA） 1 概述

细胞内有小核RNA(small nuclearRNA)，简称snRNA。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。另外，还有端体酶RNA(telomerase RNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisense RNA)，它参与基因表达的调控。

mRNA最后翻译为蛋白质，而rRNA、tRNA及snRNA等并不携带翻译为蛋白质的信息，其终产物就是RNA。 2 作用

真核细胞有细胞核和细胞质中都含有许多snRNA，它们约有100到300个碱基，每个细胞中可含有105-106个这种RNA分子。它们是由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ所合成的，其中某些像mRNA一样可被加帽。在细胞核中的小RNA称为snRNA，而在细胞质中的称为scRNA。但在天然状态下它们均与蛋白质相结合，故分别称为snRNP和scRNP。某些snRNPs和剪接作用有密切关系。有些snRNPs分别和供体及受体剪接位点以及分支顺序相互补。snRNAs中最受注意的一个是U1，它普遍存在于哺乳动物、鸟类和昆虫细胞中。人U1snRNP中除RNA外，还有8个蛋白质分子。人U1snRNA的可能二级结构，其5'端的11个核苷酸是单链的，并有一段和内含子左侧的供体序列互补。在供体位点处的互补序列通常为4-6bp。在体外，完整的U1snRNP粒子能和左侧共同顺序结合，但纯化的U1snRNA却不能。U1snRNA参与剪接的证据是抗U1snRNP的抗体可以在体外抑制剪接作用；而且如果从系统中将U1snRNP除去，剪接即不能进行。事实

上，除去U1sn RNA5'端的几个核苷酸即可抑制体外剪接作用。

有可能U5snRNA能识别右侧(受体位点)共同顺序；而U2snRNA，则具有与分支位点互补的顺序。抗U2snRNP的抗体可以和U2snRNA及包括分支位点在内的内含子所形成的复合体发生免疫沉淀。U1和U2可能参与剪接反应的起始阶段，因为U1和U2的灭活将阻止左侧连接点的切断和套索的形成。另外两个snRNAsns(U4和U6)可能亦参与剪接作用，但它们的功能尚不详。一般认为，脊椎动物细胞有6种不同的snRNAs，称为U1、U2、U3、U4、U5和U6。最小的是U6，有约100核苷酸长。最大的是U3，也不过215核苷酸长。它们和蛋白质结合成snRNPs。系统性红斑狼疮(SLE)患者和某些风湿病患者的血清中常可检出对snRNPs中某些蛋白质的自身抗抗体。 六、RNA干扰（RNAi） 1 RNAi的定义

目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义： ① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。

② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。

如果将其作为一门生物技术，则定义为：

① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ，从而诱导内源靶基因的mRNA 降解，达到阻止基因表达的目的。 ② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。 ③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。

各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。 2 概述

最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。

这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的，是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。

这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。

有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6或者RNaseP的组分H1 RNA转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象。

另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。 3 RNA干扰技术的应用

RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验。注射siRNA之后，小鼠

肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。

上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。

总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。

将dsRNA触发的RNAi作为基因组的―免疫系统‖，人们可能要问：转座子和病毒是如何诱导与它们自己序列相对应的dsRNA 的？在线虫，至少可有三个可能的解释。第一，一旦一个基因单元已经将多个拷贝插入基因组的任意位置，从启动子端开始连续转录可以从两条链产生RNA，形成dsRNA。这种情况出现的机会将随着插入的数量而增加， 这将提供一个感受随机整合的拷贝数的装置，存在于基因组中的一种转座子扩散的感受器。第二， 在线虫中的知道要被RNAi调节的转座子有末端反向重复序列。一个单拷贝的连续阅读转录能够产生与这些末端对应的折回dsRNAR。我们在线虫中确实观察到与转座子末端对应的dsRNA 。 第三，可能存在其他转座子感受器 。所有\好\基因在它们的mRNA中分享结构基序，甚至可能是5 和 3 端之间的相互作用，及蛋白质因子与它们的结合。 缺乏这些特征的mRNAs 通过一个特殊的装置转变成dsRNA。转座子沉默有缺陷的几个线虫突变，在给予dsRNA后在RNAi中没有缺陷 ，可能存

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