QPCR常见问题(2)

率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。 Q：扩增曲线本底不断升高是什么原因? A：1、试剂质量差是主要原因； 2、模板不纯是一个重要原因； Q：只要Cq值大于30都是阴性吗？

A：要与对照品比对才能定性分析。不过一般Cq值大于30结果置信度降低，需要多次确认。

常规修饰基团分子量 5’-Biotin……405.45 3’-TAMARA……623.60 5’-(6 FAM)……537.46 3’-Dabsyl……498.49 5’-HEX……744.13 3’-(6 FAM)……569.46 5’-TET……675.24 3’-Amino Modifier C3……153.07 5’-Cy5……533.63 3’-Amino Modifier C7……209.18 5’-Cy3……507.59 3’-Thiol Modifier C3……154.12

Q：待测基因的Cq值大多在18~25之间，但内参的Cq值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Cq值还是在12~14之间。以这样的数据分析会影响结果的准确度吗？

A：每次都做阴性对照并且阴性对照Cq为0，那Cq30就肯定不是污染，而是基因表达量低或是模板太稀。内参Cq为10~14都正常，没必要再稀释模板了。不过内参Cq低于10，结果可能会有偏差。

Q：请问下现在的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都要求要有临界阳对照吗？这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？还有临界阳用阳性对照来稀释来得到可以吗？

A：阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你知道临界阳性的浓度，经过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。 Q：real time PCR结果熔解曲线中出现了负值？

A：这个曲线反应的是随着温度的变化荧光值的变化速率。值越高，则此时PCR产物荧光值变化越快，也就是说PCR产物变性速度最快。当温度达到Tm值时PCR产物迅速变性，荧光值急剧下降，表现在这张图上就是出现一个峰。产物越纯，峰越窄，PCR产物越多，峰越高。这样看来出现负值表明此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快。70-80度时，已经出现变性，但是较为缓慢。但是你的产物看来不是特别纯，峰比较宽。

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