分子生物学之应用与发展

分子生物学之应用与发展

授 课 教 师：李 元 凤

一 、重组DNA (Recombinant DNA)的步骤

1. 选择载体(cloning vector)

2. 以适当的限制脢(restriction endonuclease)切分载体

3. 将欲选殖或增幅之外来DNA与载体接合(ligation)，形成杂合DNA (hybrid

DNA)

4. 将杂合DNA送入宿主(host)细胞中，此谓转型(transformation) 5. 筛选及鉴定正确之杂合DNA

?载体的来源

1. 细菌: 细菌体内含有会自行复制之小分子核酸个体 2. 噬菌体(bacteriophage)

3. 酵母菌(yeast): 酵母菌体内含有会自行复制之核酸个体

?重组DNA的来源 1. 化学合成

2. 大分子DNA以限制脢切成小分子DNA 3. mRNA反转录(reverse transcription)合成cDNA ?转型

1. 利用细菌转型法将杂合DNA送回细菌体内 2. 利用酵母菌转型法将杂合DNA送回酵母菌体内

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二、 分离与选殖单一基因

1. 重组DNA技术可以增幅，或是鉴定未知基因之DNA序列及其功能。若要

选殖基因，则需先建立基因库(genomic library)，筛选各种基因。

2. 筛选的方法有数种，最常用的方法之一为南方点墨杂交法(Southern

hybridization)

?重组DNA技术的应用

1. 重组蛋白质(recombinant protein)之生产 2. 基因改造之物种(农作物或微生物) 3. 基因治疗(gene therapy)

三、 以聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)来增幅DNA

1. 如果DNA序列已知的话，则可用PCR来大量增幅此DNA片段

2. PCR反应需要三种主要成分: 人工合成的DNA引子(primers)，耐热DNA聚

合脢(polymerase)及去氧核糖核甘酸(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

3. PCR以下列三个步骤做循环反应: 变性(denaturation)， 黏合(annealing)及

DNA合成(polymerization)反应

四、 PCR的应用

1. 医学诊断(medical diagnostics): 传染性病源，遗传疾病，癌症 2. 法医学(Forensics): DNA fingerprint

五 、微点阵(Microarray)及生物晶片(Biochip)

1. 将探针(通常是DNA或cDNA)以高密度点阵排列在一小片基质上，即所谓”

晶片”。

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2. 待测样本与此晶片上的探针做杂交。只需一次实验，DNA/cDNA晶片就能

够将成千上万的基因序列或表现型式记录下来。

六、 以分子遗传学筛检海洋性贫血(Thalassemia)

海洋性贫血是一种先天遗传性的血液疾病，人体之正常红血球含有A， A2 及F三种血红素，这些血红素皆由四条血红蛋白链组成，分为????(HbA),?2?2(HbA2), ?2?2(HbF)。如基因突变则造成某种血红蛋白链合成不足，而其他蛋白链合成过剩，导致造血不足或易溶血之现象，即为贫血。血红蛋白链基因分析的检体可来自血液，羊水或胎盘之绒毛。DNA分析有下列两种方法:

1. 南方点墨杂交法(Southern hybridization)

利用血红蛋白链的基因做探针(probe)与待测DNA杂交，经由电泳分离后，以其特殊之型式诊断是否有基因突变。

2. 聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)

以PCR方法大量复制检体内血红蛋白链的基因，利用限制脢片段长度多型性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)或直接作DNA序列分析(sequencing analysis)，检查是否有基因突变。

七、 以分子遗传学检定乳癌/卵巢癌之BRCA1 & BRCA2基因变异

大部分的遗传性卵巢癌是由基因BRCA1的变异所引起。近几年之族群研究显 示，20%至30%带有BRCA1基因变异的女性，在四十岁之后将有得到卵巢癌的可能性。带有BRCA2基因变异的人则较可能发生早期性乳癌，目前显示近35%的遗传性卵巢癌患者也带有BRCA2基因的变异。BRCA1基因片段先经由聚合脢连锁反应增幅后，以下列三种方法分析其变异 (mutation):

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? 单股DNA结构多型性(SSCP)分析: 不同的DNA序列，电泳分离后之位置

不同，此法可分析DNA是否有变异。

? DNA序列分析(sequencing analysis): 可鉴定DNA之变异位置及种类。 ? DNA 晶片(DNA chip)分析: 可同时分析整个BRCA1基因。

? 参考资料:

1. Becker WM, Kleinsmith LJ, and Hardin J. World of the Cell. The Benjamin

/ Cumming Publishing Company. 2000

2. Brown TA. Genome. BIOS Scientific Publishers, 1999

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生物老化与卡路里的关系

授 课 教 师：李 元 凤

一、 细胞老化: 以酵母菌为例

? 酵母菌之老化是以母细胞分裂次数计

? 限制培养基内之卡路里含量可延长酵母菌20-40%的寿命

? 酵母菌寿命延长亦可经由己糖激脢(hexokinase)之失活 (己糖激脢促进葡萄

糖之活化)而达成

二、 以演化生物学的观点看老化: 果蝇为模式的研究

三、 老化指标(Biomarkers of aging) :

? 血压，血清葡萄糖， 胰岛素， 尿酸含量 ? 葡萄糖代谢及胰岛素调节之能力 ? 神经纤维委缩 ? 细胞分裂能力下降 ? 体质量(BMI) ? 肥胖指数

? 肺功能，手握力(grip strength)

四、 减少50-70%卡路里摄取(caloric restriction)减缓生物细胞老化的速度及老

年疾病的发生

由老鼠实验结果证明，减少30-50%卡路里的摄取

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