植物一氧化氮NO酶联免疫分析ELISA

植物一氧化氮(NO)酶联免疫分析（ELISA）

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物一氧化氮(NO)含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物一氧化氮(NO)水平。用纯化的植物一氧化氮(NO)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物一氧化氮(NO)抗原，再与HRP标记的一氧化氮(NO)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物一氧化氮(NO)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物一氧化氮(NO)抗原浓度。

试剂盒组成： 试剂盒组成 说明书 封板膜 密封袋 酶标包被板 标准品：135ng/L 标准品稀释液 酶标试剂 样品稀释液 显色剂A液 显色剂B液 终止液 浓缩洗涤液 48孔配置 1份 2片（48） 1个 1×48 0.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 3 ml×1瓶 3 ml×1瓶 3 ml×1瓶 3 ml×1瓶 3ml×1瓶 （20ml×20倍）×1瓶 96孔配置 1份 2片（96） 1个 1×96 0.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 6 ml×1瓶 6 ml×1瓶 6 ml×1瓶 6 ml×1瓶 6ml×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存 2-8℃保存

标本要求：

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：

1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标

准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，

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2.

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90ng/L，60 ng/L ，30 ng/L，15 ng/L，7.5 ng/L）。

加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 温育：操作同3。 洗涤：操作同5。

显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意事项：

1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未

用完，板条应装入密封袋中保存。

2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好

控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值

大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6． 底物请避光保存。

7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9． 本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

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计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。 2.批内与批见应分别小于9%和11%

检测范围： 3.5 ng/L -120ng/L 保存条件及有效期： 1.试剂盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6个月

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（此图仅供参考）

Plant NO

FOR RESEARCH USE ONLY

Drug Names

Generic Name：Plant NO ELISA Kit.

Purpose

This kit allows for the determination of NO concentrations in Plant tissue ,cell and other samples.

Principle of the assay

The kit assay Plant NO level in the sample，use Purified Plant NO antibody to coat

microtiter plate wells, make solid-phase antibody, then add NO to wells, Combined antibody which With HRP labeled,become antibody - antigen - enzyme-antibody complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of NO in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.

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Materials provided with the kit

Materials provided with the kit User manual Closure plate membrane Sealed bags Microelisa stripplate Standard：135ng/L Standard diluent HRP-Conjugate reagent Sample diluent Chromogen Solution A Chromogen Solution B Stop Solution wash solution 48determinations 1 2 1 1 96 determinations 1 2 1 1 Storage 2-8℃ 2-8℃ 2-8℃ 2-8℃ 2-8℃ 2-8℃ 2-8℃ 2-8℃ 2-8℃ 0.5ml×1 bottle 1.5ml×1 bottle 3ml×1 bottle 3ml×1 bottle 3ml×1 bottle 3ml×1 bottle 3ml×1 bottle （20ml×20 fold） ×1bottle 0.5ml×1 bottle 1.5ml×1 bottle 6ml×1 bottle 6ml×1 bottle 6ml×1 bottle 6ml×1 bottle 6ml×1 bottle （20ml×30 fold） ×1bottle Specimen requirements

1. extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevant literature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t, specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles. 2. Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active.

Assay procedure

1.Dilute and add sample to Standard: set 10 Standard wells on the ELISA plates coated, add Standard 100μl to the first and the second well, then add Standard dilution 50μl to the first and the second well, mix; take out 100μl form the first and the second well then add it to the third and the forth well separately. then add Standard dilution 50μl to the third and the forth

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