欧洲药典EP5.0(2)

动态浊度法实验（方法C）是一种测定反应混合物达到预定吸光度所需的时间（反应时间）或浊度变化率的方法。

该实验应在试剂生产商推荐的恒温温度下进行（通常是37?1℃）。 2. 显色法技术（方法D和E）

该技术是用来测定内毒素与鲎试剂反应中的显色肽释放出来的显色团。依据所使用的实原理验，本技术分为终点显色法实验或动态显色法实验。

终点显色法（方法E）是基于反应结束时内毒素浓度与释放出来的显色团数量之间的定量关系。

动态显色法（方法D）测定反应混合物达到预定吸光度所需的时间（反应时间）或颜色变化率。

该实验应在试剂生产商推荐的恒温温度下进行（通常是37?1℃）。 3. 预备性实验

为了确保浊度法和显色法实验的精确性或有效性，需进行预备性实验以确保标准曲线符合规定以及供试品溶液不会干扰实验。

当有可能影响实验结果的任何实验条件发生改变，要求对实验方法进行验证。 （i） 标准曲线的可靠性实验

使用内毒素标准品溶液制备至少3个内毒素浓度建立标准曲线，每个浓度的内毒素标准品溶液至少重复3管并按照试剂生产商的建议（容液比例，恒温时间、温度、pH等等）进行实验。

使用动态方法时，如果要求的范围大于两个对数数量级，则应该在标准曲线范围内添加额外标准品来支持每个对数数量级的递增。

在试剂生产商指定的内毒素浓度范围内，相关系数的绝对值|γ|必须大于等于0.980。

（ii） 干扰实验

选择一个内毒素标准曲线中点或靠近中点的内毒素浓度。

按照表2.6.14-4制备溶液A、B、C和D，按照试剂生产商的建议（供试品溶液和试剂溶液的量，供试品溶液和试剂溶液的量的比例、恒温时间等等）至少重复2管进行实验。

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表2.6.14-3

溶液 A B C D 内毒素浓度/加入内毒素的溶液 无/供试品溶液 2?/供试品溶液 2?/检查用水 无/检查用水 稀释剂 - 供试品溶液 检查用水 - 稀释倍数 1 2 4 8 1 1 2 4 8 - 初始内毒素浓度 重复管 - 2 - 2 - 2 - 2 2 2? 2 2? 2 1? 2 0.5? 2 0.25? - 2 溶液A=稀释倍数不超过MVD的供试品溶液，已做过干扰实验，供试品溶液的进一步的稀释亦不能超过MVD，根据干扰实验结果，使用检查用水制备两个稀释系列1，1/2，1/4和1/8，也可使用其它合适的稀释系列。

溶液B=含有2?内毒素标准品的溶液A（阳性产品对照）

溶液C=含有2?、?、0.5?、0.25?浓度的内毒素标准品的两个检查用水系列。 溶液D=检查用水（阴性对照）

表2.6.14-4

溶液 A B C D 内毒素浓度 无 标准曲线中点浓度 至少3个浓度（?为最低浓度） 无 加入内毒素的溶液 供试品溶液 供试品溶液 检查用水 检查用水 重复管数 不少于2管 不少于2管 每个浓度不少于2管 不少于2管 溶液A=供试品溶液，可用不大于MVD的稀释倍数稀释。 溶液B=含中点浓度的供试品溶液，与溶液A稀释倍数相同

溶液C=内毒素标准品溶液，浓度同3. 预备性实验（i）标准曲线可靠性实验（阳性对照）的验证实验中的浓度。

溶液D=检查用水（阴性对照）

用含有添加内毒素的供试品溶液的平均浓度减去未添加内毒素的供试品溶液的平均浓度来计算添加的内毒素的平均回收率。

如果在实验条件下，测得加入供试品溶液中的内毒素的浓度在已知添加的内毒素浓度的50%-200%范围内，则供试品溶液无干扰。

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当内毒素回收率超过指定范围，应按照凝胶法技术中1. 预备性实验（ii）干扰实验所述的方法去除干扰因子。

4. 实验

(i) 过程

按3. 预备性（ii）干扰实验的实验过程。 (ii) 计算

使用阳性对照系列溶液C创建的标准曲线计算溶液A的每支重复管的内毒素浓度。

实验只有符合以下三个要求才有效：

（a）溶液D（阴性对照）的结果不超过所使用的试剂要求的空白值的限值； （b）阳性对照系列溶液C的结果符合3.预备性实验（i）标准曲线可靠性实验中所定义的验证的要求

（c）用溶液B的内毒素浓度减去溶液A的内毒素浓度计算出来的内毒素回收率在50%-200%范围内。 (iii) 判断

如果溶液A的重复管的内毒素浓度平均值小于产品的内毒素限值，则所检产品合格。

5. 试剂

（i） 试剂溶液

按照鲎试剂生产商的建议，用检查用水或缓冲液溶解鲎试剂，轻轻搅动，将复溶的试剂按生产商的指示冷藏或冻结。 （ii） 鲎试剂

鲎试剂是一种冻干产品，从鲎（美洲鲎或东方鲎）的阿米巴细胞获得，该试剂是按照有关当局的管理条例生产的。

除了内毒素外，鲎试剂还与某些?-葡聚糖反应，不与葡聚糖反应的鲎试剂也有供应；他们是通过去除鲎试剂中的与葡聚糖反应的G因子或抑制鲎试剂中G因子反应体系来制备的。这种试剂可用于出现葡聚糖的内毒素实验。 （iii） 检查用水（细菌内毒素检查用水）

检查用水是注射用水或用其他方法制备的不与实验所使用的试剂反应的水。

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