细胞生物学实验设计(7)

4. 如何证明染色体骨架的存在?（答案）

答: 可用两种方法:

①分离有丝分裂前的染色体, 用试剂溶解组蛋白和大多数主要的非组蛋白, 然后在电子显微镜下观察, 如见一完整的染色体结构框架(framework)或支架(scaffold)则证明有染色体骨架的存在。

②采用不同荧光标记探针与人的DNA进行原位杂交实验, 若能证实在染色质包装时, 有染色质环的形成, 则证明有染色体骨架的存在。在这些实验中,探针的使用是一个关键, 最好是这些探针的作用位点靠近推测的特定的DNA序列, 即支架结合区(scaffold-associated regions, SARs), 又称基质结合区(matrix-associated regions,MARs)。SARs 是位于DNA中活性基因转录两端, 或放射环两端的DNA序列, 富含AT。在MAR中存在有拓扑异构酶II的作用位点, DNA可能通过MAR与DNA拓扑异构酶的结合, 锚定于核骨架上。可通过用限制性酶水解除去球蛋白的染色体,然后再与支架蛋白结合找出DNA片段的方法绘制SARs图。 通过转基因鼠的实验表明, 在某些情况下, 基因的转录需要邻近的SARs的存在。在果蝇中, SARs将两个转录单位隔开, 因此蛋白质调节一个基因转录时并不影响由SARs隔开的基因表达。

原位杂交分析放射环的原理是: 由于各探针在显性DNA上作用位点间的距离都在几百万碱基对, 如果这些位点都在同一个放射环上, 那么杂交后显示的距离就很短。

设计实验 >> 12. 细胞周期与细胞分裂

1. 如何利用胸腺嘧啶和秋水仙素获得同步培养的细胞？（答案）

答: 高浓度的胸腺嘧啶能够阻断DNA合成所需的核苷酸的合成, 因此将细胞群体培养在具有高浓度的胸腺嘧啶的培养液中时, 非同步化的细胞能够正常地通过细胞周期, 但到达S期时, 因DNA的合成被阻断, 这些细胞不能顺利通过S期进入G2期。经过对S期的短暂阻断, 再改变胸腺嘧啶的浓度, 解除抑制, 所有的细胞都开始DNA的合成, 即获得处于同步生长的细胞。

秋水仙素可抑制微管的聚合, 因而抑制有丝分裂器的形成, 将细胞阻断在有丝分裂的中期， 适当时间后解除秋水仙素的作用，即获得处于中期的同步化的细胞。这一方法称为中期阻断法。

2. 有丝分裂选择法和细胞沉降分离法获得同步化细胞方法的原理有何不同？（答案）

答: 有丝分裂选择法是根据细胞在细胞周期的不同阶段的生理变化设计的一种方法。单

层培养于细胞培养瓶内的非同步化的细胞群体中, 处于对数期增殖的细胞分裂活跃, 分裂指数高, 分裂细胞变圆、隆起, 与培养器的粘着性降低。此时轻轻摇动, M期的细胞就脱离器皿壁而悬浮于培养液中, 其它阶段的细胞则不会脱落。将倾出培养液贮存于4℃保存, 再向培养瓶中加入37℃新鲜培养液继续培养, 经1-2小时, 再如同上法收集M期的细胞。每1～2小时摇动并收集细胞, 最后集中所收集的培养液,离心后, 可获得一定数量的M期的同步化细胞。此法的优点是不受药物的影响, 同步化程度高, 不足之处是分离的细胞少, 手续繁琐。

细胞沉降分离法主要用于悬浮培养的细胞。由于细胞在其周期过程中, 体积逐渐增大, 所以处于细胞周期不同阶段的细胞体积不同。而细胞在某一离心力场中的沉降速度与其半径平方成正比, 因此可用沉降法分离所处周期时相不同而大小不同的细胞。

3. 什么是染色体早熟凝集实验？为什么同步化的M期细胞与其他时期的细胞融合，早熟凝集的染色体形态不同？（答案）

将处于分裂期的细胞（M期）与处于细胞周期其他时期（G1期、S期、G2期）的细胞融合, M期的细胞质总是能够诱导非有丝分裂的细胞中的染色质凝集, 将这种现象称为染色体早熟凝集(premature chromosome condensation,PCC)。由于G1期、S期和G2期细胞中染色质的复制状态不同, PCC的结果也不相同, 如与M期细胞融合的G1期的染色体为单线状, S期为粉末状, G2期染色体为双线。致于早熟凝集的染色体形态为什么不同，主要与各期DNA复制的状态有关：S期的细胞与M期的细胞融合, 早熟的染色体呈粉末状, 原因是正在复制的DNA易受损伤,是DNA断裂的结果；而M期细胞与G1期细胞融合，出现细线状，是由于染色体还没有完全去凝集，DNA复制尚未开始。由于G2期DNA已经复制完全，所以与M期细胞融合呈现双线状。

这些研究结果说明处于M期的细胞中一定有一种使染色体由松散状态凝聚成染色体的物质存在。

4. 在研究促使G1期细胞DNA复制以及诱导细胞提前进入有丝分裂的调节因子的本质时, 为什么选用蛙和无脊椎动物的卵母细胞及早期的胚进行注射实验？（答案）

答: 一些动物的受精卵特别适合作为细胞周期的研究材料, 因为这些卵细胞特别大, 如蛙的卵细胞的直径可达1 mm, 并且在受精后进行快速胚胎发育, 通过细胞周期进行分裂, 产生许多小细胞。在每个细胞周期之间,G1期和G2期很短, 或没有G1期和G2期, 但是都有S期和M期。在受精卵的发育过程中, 没有新基因的转录, 因为胚胎早期发育阶段所需的mRNA和大多数蛋白质都是在卵母细胞形成时就合成好了并被包装在成熟的卵细胞中。另外

在早期的细胞分裂周期中,细胞也不会生长,所有的细胞都是通过对称分裂形成两个小细胞。

在细胞周期的特定阶段分离蛙的卵细胞, 并从蛙卵细胞中制备提取物。为了检测蛙卵提取物的生物活性,将它注射到非洲爪蟾的卵母细胞(未受精卵的不成熟的前体),观察这些提取物对细胞周期的影响。这种卵母细胞是检测提取物活性的良好系统, 因为这种细胞已经完成了DNA复制并正好停留在第一次有丝分裂的M期之前,, 如果注射物具促分裂活性的话, 即可使注射的卵母细胞进入M期。因此卵母细胞所处的细胞周期阶段等于周期细胞的G2期。

5. 请设计一个实验分离芽殖酵母G1周期蛋白，并说明其原理。（答案）

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答: 为了鉴定芽殖酵母的G1期周期蛋白，首先要获得芽殖酵母cdc28基因的温度敏感突变体, 这样，当该G1周期蛋白基因高水平表达时, 能够抑制某些温度敏感性cdc28突变体。这种方法的基本原理是:某些cdc28突变体可以是温度敏感的, 这样, 在非允许温度下突变的Cdc28蛋白与G1周期蛋白的亲和力就低。在这种情况下, 如果G1周期蛋白的浓度足够高, 它能够与突变的Cdc28蛋白形成足够的SPF,促使细胞在非允许温度下进入S期。

科学家通过基因工程手段分离到两个G1周期蛋白基因:CLN1和CLN2, 它们能够按预测的方式抑制cdc28突变(图12-17)。后来, 科学家用又分离鉴定了一个显性的G1周期蛋白基因: CLN3,是在野生型细胞中起作用的周期蛋白基因。

(a) 野生型细胞能够产生高亲和力的Cdc28蛋白, 这种蛋白在25℃和36℃下与G1周期蛋白结合形成SPF。(b) 某些cdc28ts突变体表达的Cdc28蛋白与G1周期蛋白的亲和力低, 在允许温度(25℃)能够形成足够的Cdc28ts-G1周期蛋白(SPF),能把生长并形成菌落; 但是在非允许温度(36℃),不会形成SPF,不会形成菌落。(c)用从芽殖酵母基因库的高拷贝克隆载体转化cdc28ts 细胞,在36℃下形成三种类型的菌落:一种含有野生型的CDC28基因, 另两种含有突变的基因CLN1和CLN2。在由CLN1和CLN2基因转化的细胞中, 由于G1周期蛋白的

浓度很高, 在36℃下能够形成足够的SPF, 促使细胞进入S期, 并进行有丝分裂。

设计实验 >> 13.胚胎发育、分化与调控

1. Hans Spamann和Hilde Mangold是如何通过蝾螈胚胎移植实验证明了初级诱导？（答案）

答: 胚胎诱导一般发生在内胚层和中胚层或外胚层和中胚层之间。从诱导的层次上看, 分为三级, 即初级诱导、二级诱导和三级诱导。能够诱导新胚胎形成的现象称为初级胚胎诱导。

在原肠胚形成过程中，位于胚孔上方的细胞将内陷到胚胎的内部，产生一种多层结构，其中有些细胞直接处于将发育成神经细胞的层面。为了在新内陷的细胞中寻找是否存在有决定神经细胞发育的细胞，他们将一种原肠胚胚孔的动物极的细胞移植到另一个原肠胚不同位置。为了区别供体和受体，将它们用不同的色素进行染色。结果是移植的胚孔物质诱导宿主发育成一个全新的胚胎：一个复合双生体（图E13-1）。

图E13-1 胚胎初级诱导作用的试验证明

将有色素的蝾螈原肠胚胚孔背唇细胞移植到无色素蝾螈原肠胚，出现第二个胚胎发育，如同复合双生。由于复合双生是无色素的，那么有色素的背唇细胞必须被无色素的宿主细胞诱导分化成第二个胚。

2. 请根据鸡的肢芽（limb buds）发育的研究，设计一个实验证明位置信息在形态建成中的作用。（答案）

答: 鸡胚胎的腿和翅开始是由一小团中胚层发育形成肢芽，肢芽早期为舌形突起, 内部为中胚层来源的间叶组织, 表面覆盖着外胚层表皮。当肢芽逐渐长长时，肢芽就会发育成适当的骨组织，并在肢芽的末端形成指。指导肢芽形成的位置信息是由中胚层组织的一小块区域发出的，该区域称为极性激活带(zone of polarizing activity, ZAP),它位于肢芽的后端附近。如果将此处的组织移植到另一个肢芽的前端，其结果会发育成正常个体的两倍数量的指（图E13-2），这就是位置信息对发育的影响。

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