食品生物技术实验

实验1 糖化酶固定化技术

1 实验目的

(1)熟悉酶的固定化技术和原理。 (2)掌握糖化酶的固定化操作。

2 实验原理

在一定pH条件下，带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物，同时，海

藻酸钠与钙离子在一定条件下结合形成不溶于水的微球，从而使混合于其中的糖化酶通过包埋固定化。戊二醛含有两个醛基，可与蛋白质中的氨基、酚基、巯基发生反应，相互交联而使固定化酶硬化，由于带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物已将绝大部分游离酶包埋起来，因此这种交联主要发生在明胶与戊二醛之间，使固定化酶的使用时间延长、机械强度增大、稳定性提高。

3 仪器和试剂

3.1 主要仪器

磁力搅拌器，pH计，水浴锅，500mL烧杯，50mL注射器，12号注射器针头，冰箱。 3.2 药品及配制

（1）所需药品：糖化酶，明胶，海藻酸钠，氯化钙，戊二醛，生理盐水。 （2）活力单位为70U/mL的糖化酶酶液100ml：用所给糖化酶配制。 （3）浓度为3%的明胶溶液150ml：称取明胶4.5g，放入装有150mL蒸馏水的烧杯中，静止10分钟，水浴加热使明胶溶解，注意水浴的温度不超过70℃。

（4）3%的海藻酸钠溶液150ml：称取海藻酸钠4.5g，放入装有150mL蒸馏水的烧杯中，不断搅拌同时加热煮沸彻底溶解。

（5）1％氯化钙溶液500ml。 （6）5％的戊二醛溶液500ml。 （7）5％稀盐酸：调节pH用。

4 实验操作

将15mL糖化酶液与40℃150mL3％的海藻酸钠溶液混合搅拌，加入40℃

150mL3％的明胶溶液混合乳化约10min，调pH为4.2~4.6，缓慢搅拌并降温至5～

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10℃，用12号注射器的针头将上述冷却液从3cm的高度注进1％氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球，然后保持温度为4℃，球在氯化钙溶液中被硬化30min，将球取出置人30℃ 5％的戊二醛溶液中进一步硬化1h，用生理盐水洗涤后，过滤得固定化糖化酶，贮存在0～5℃冰箱中备用。

5 实验结果

观察所得固定化糖化酶的色泽和形状，粗测其粒度大小，测量其体积和沥干水后的重量，把所得各项指标填入下表：

表1 所得固定化糖化酶的外观、体积和质量

形状及大小 色泽 总体积（ml） 总重量（g）

6 思考题

1． 本实验的固定化方法是所述哪几种酶固定化方法的结合? 2． 为何固定时乳化液的pH要保持在4.2~4.6？

实验二 固定化糖化酶活力的测定

1 实验目的

（1）学习固定化糖化酶活力的测定方法。

（2）了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。

2 实验原理

糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括淀粉β-1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉α-1，4-葡萄糖糖苷酶（糖化酶）和淀粉β-1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。本实验的研究对象是淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。

碘量法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖具有还原性，其醛

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基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。

I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O

NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI

体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。

I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI

3 仪器和试剂

3.1 主要仪器

吸管（25ml、10ml、5ml、2ml）、定碘瓶、碱式滴定管、恒温水浴锅、分析天平。 3.2 试剂

（1）2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。

（2）0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液

称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.72g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）20%氢氧化钠溶液 （4）0.1mol/L碘液

称取碘化钾35g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中，定容至 1000ml贮存于棕色瓶中。

（5）0.1mo1/L氢氧化钠溶液

称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。

（6）1mol/L硫酸溶液

量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。

（7）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液

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配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。

4 实验方法步骤

（1）固定化糖化酶的称量

称取实验一所得固定化糖化酶重量的2/15(相当于原酶液2mL)，待用。 （2）酶活力的测定

于甲、乙、丙三个三角瓶中，分别加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/L pH4.6的乙酸缓冲液5ml，摇匀，在40℃的恒温水浴中预热5-10min，在甲管中加入待测酶液2ml(酶活总量约100-170单位)，乙管中加入已经称量好的固定化酶，丙管加2ml蒸馏水作对照，摇匀，立即记时。准确反应1h后（加固定化酶的三角瓶在反应过程中应不断搅拌），取出各加20%NaOH溶液0.2m1终止酶反应，冷却至室温。

取上述反应液5m1放入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘液10ml，再加入0.1mol/L氢氧化钠15ml，摇匀后暗处放置15min。加入1mol/L硫酸2m1，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。

5 结果计算

5.1 计算原酶液和所得固定化糖化酶的活力

糖化酶活力单位的定义：在40℃、pH4.6的条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。

酶活力单位=（A-B)N ×90.05 ×（1/2） ×（32.2/5） ×n

式中 A——空白所消耗硫代硫酸钠体积（ml）； B——样品所消耗硫代硫酸钠体积（ml）； N——硫代硫酸钠浓度（0.1mol/L）；

90.05 ——1ml l mol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质量（mg）；

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1/2 ——折算成1m1酶液的量 32.2——反应液总体积（ml）

5 ——吸取反应液样品的体积（ml）； n ——酶液稀释倍数。 5.2 计算固定化酶的活力回收率

固定化酶活力回收率=

固定化酶总活力 用于固定化的酶的总活力

× 100%

6 思考题

（1）该实验中影响糖化酶活力单位测定值的因素主要有哪些？

（2）比较分析DNS比色法、斐林试剂热滴定法与碘量法三种测定糖含量方法的特点。

实验三 干红葡萄酒的酿制

葡萄酒是葡萄汁发酵而成的低度酒精饮料，它的主要成分有单宁、酒精、糖分、有机酸等。葡萄酒的品种繁多，按酒色分为白葡萄酒、桃红葡萄酒、红葡萄酒；按酒中糖分含量分为干葡萄酒、半干葡萄酒、半甜葡萄酒、甜葡萄酒；按饮用方式分为餐前、佐餐和餐后葡萄酒；按酿造方法分为天然葡萄酒、加强葡萄酒、添香葡萄酒；按酒中CO2含量分为静酒和起泡酒。葡萄酒的生产工艺成熟，原料来源丰富。既可工厂大规模生产，又可庄园小批量酿造。

一、实验目的

学习葡萄酒酿制的原理，掌握葡萄酒主要理化指标及其测定方法。 二、实验原理

葡萄酒的酿造原理是利用葡萄皮自带的酵母或人工接种的酵母菌，将葡萄汁中的葡萄糖、果糖发酵，生成酒精、二氧化碳，同时生成副产物高级醇、脂肪酸、挥发酸和酯类等，并将葡萄原料中的色素、单宁、有机酸、果香物质、无机盐等所有与葡萄酒质量有关的成分，都带到发酵的原料酒中，再经陈酿澄清，使酒质达到清澈透明、色泽美观、滋味醇和、芳香宜人。

三、实验材料与仪器

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