酶工程考点

2016年酶工程复习要点（老师给）

1. 酶工程的发展历史；氨基酰化酶、青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、天冬氨酸酶等酶的应用；常见酶如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、糖苷酶和果胶酶等的作用机理；酶的三大催化特性；

a) 氨基酰化酶：催化DL-氨基酸生产L-氨基酸。

b) 青霉素酰化酶：青霉素酰化酶，又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。该酶已

大规模应用于工业生产β- 内酰胺类抗生素的关键中间体和半合成β- 内酰胺类抗生素。

c) 葡萄糖异构酶：用于淀粉酶生产，进行葡萄糖异构化反应。生产果葡糖浆，以代替

蔗糖。

d) 天冬氨酸酶：催化富马酸和氨生成天冬氨酸。

e) 蛋白酶:将蛋白质多肽链从中间切断或从两端逐一水解，生成氨基酸。 f) 脂肪酶:水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。 g) 纤维素酶：复合酶，降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。 h) 糖苷酶：又称糖苷水解酶，是所有可水解糖苷键的酶类的总称。 i) 果胶酶：是指分解植物主要成分—果胶质的酶类。

j) 酶的三大催化特性:专一性强、催化效率高、作用条件温和。

2. 酶生物合成的调节机理（主要是原核生物）：转录水平调节，操纵子概念；分解代谢（葡萄糖效应原理）、诱导阻遏（诱导物的种类）、代谢产物阻遏；

a) 原核生物中酶合成的调节主要是转录水平的调节，主要有三种模式，即分解代谢物

阻遏作用，酶合成的诱导作用和酶合成的反馈阻遏作用。

b) 操纵子（operon）是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单

位。

c) 分解代谢物阻遏作用（葡萄糖效应）：当葡萄糖作碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷

酸环化酶有抑制作用，cAMP的浓度降低，导致CAP-cAMP复合物减少，启动基因的相应位点没有足够的CAP-cAMP复合物结合，RNA聚合酶无法结合启动基因的相应位点，转录无法进行，酶的生物合成受到阻碍。

d) 酶合成的诱导作用是加入某些物质使酶的生物合成开始或加速的现象。诱导物促进

酶编码基因的表达，一般是酶催化作用的底物或底物类似物，也可以是酶催化反应的产物。

e) 酶合成的反馈阻遏作用又称为产物阻遏作用，指酶催化反应的产物或代谢途径的末

端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。

3. 提高微生物发酵酶产量的措施（三种方法及其原理）；并结合酶生成动力学进行分析；对同步合成、滞后合成、中间合成等现象的分析及解决手段；

提高酶产量的措施有添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂和添加产酶促进剂。 a) 添加诱导物的原理：

诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。

b) 控制阻遏物浓度的原理：

有些酶的生物合成受到某些阻遏物的阻遏的作用，结果导致该酶的合成受阻或者产量降低。为了提高酶产量，必须设法解除阻遏物引起的阻遏作用。阻遏作用根据机理不同，可分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用是由酶催化作用的

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产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。 c) 添加表面活性剂的原理：

表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。非离子型表面活性剂（吐温（Tween）、特里顿(Triton)）。离子型表面活性剂对细胞有毒害作用。 d) 添加产酶促进剂的原理：

产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。 酶的生物合成的模式：

比较细胞生长和产酶的关系，可以把酶的生物合成的模式分为同步合成型、延续合成型、中期合成型和滞后合成型四种。 同步合成型：

酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式，又称为生长偶联型。该类型可以由诱导物诱导生成，一般不受任何阻遏作用。

延续合成型：

酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶的合成还可以延续一段较长时间。该类型可以是组成酶或诱导酶，一般不受产物的阻遏作用。mRNA相当稳定，受到分解代谢物阻遏时，转为滞后合成型。

中期合成型：

该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。一般受到产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。

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滞后合成型：

此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累，又称为非生长偶联型。受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶开始大量合成。

优化酶合成模式的思路：

酶的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。最理想的合成模式应是延续合成型。可以通过基因工程\\细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。

同步合成型：要尽量提高其mRNA的稳定性，为此可以适当降低发酵温度。

中期合成型：则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量延迟其生物合成停止的时间。

滞后合成型：要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始。

4. 固定化细胞、固定化原生质体发酵产酶的特点；（书本P54）

a) 固定化细胞发酵产酶的特点：

1) 提高产酶率

2) 可以反复使用或者连续使用较长时间 3) 基因工程菌的质粒稳定，不易丢失 4) 发酵稳定性好

5) 缩短发酵周期，提高设备利用率 6) 产品容易分离纯化

7) 适用于胞外酶等胞外产物的生产 b) 固定化原生质体的特点：

1) 变包内产物为胞外产物 2) 提高酶产率 3) 稳定性较好 4) 易于分离和纯化

5. 植物细胞的特点，植物细胞培养的一般过程及特征要求，如培养基特点及光照要求等。植物细胞培养产酶的具体过程及操作要点。

植物细胞的特点：

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植物细胞比微生物细胞大，体积比微生物细胞大10－10； 植物细胞生长速率和代谢速率比微生物低，生长周期长； 大多数植物细胞培养需要光照强度和光照时间； 植物细胞对剪切力敏感，对通风、搅拌的要求高。

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植物细胞培养的工艺流程： 1) 外植体的选择和培养

2) 植物细胞的获取(直接分离法，酶解法，愈伤组织诱导法，原生质体法)

3) 细胞培养（单倍体细胞培养，原生质体培养，固体培养，液体浅层培养，悬浮培养，

固定化培养） 4) 分离纯化 5) 产物

工业化植物细胞培养系统主要有两大类： 悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统。 植物细胞培养基的特点：

1) 需要大量的无机盐：除P、S、N、K、Na、Ca、Mg等大量元素（102～3×103mg/L）

外，还需要Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I等微量元素（10－2～30mg/L）；

2) 需要多种维生素和植物生长激素，如硫胺素、吡多素、烟酸、肌醇、生长素、分裂

素；

3) 氮源一般为无机氮源，可同化硝酸盐和铵盐； 4) 碳源一般为蔗糖，浓度一般为2-5% 常用的植物细胞培养基： MS培养基。 植物细胞培养的工艺条件控制：

1) 温度的控制：室温25（20～35℃）； 2) pH值的控制：5.0-6.0；

3) 溶解氧的控制：需要一定的溶解氧，但要求低剪切力，通风和搅拌不能太强烈，以

免破坏细胞。

4) 光照控制：光照对植物细胞的培养有重大影响。大多数植物细胞的生长以及次级代

谢物的生产要求一定波长的光照射，并对光照强度和光照时间有一定的要求，而有些植物次级代谢物的生物合成却受到光的抑制。因此应当根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种类不同，进行光照的调节控制。

5) 前体的添加：添加前体能提高次级代谢物的产量，如苯丙氨酸的添加能促进辣椒细

胞生产辣椒胺的产率。 6) 刺激剂的应用：常用刺激剂有微生物细胞碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶。

6. 动物细胞的特点，动物细胞培养的一般过程及其特殊性，动物细胞的器壁依赖性，动物细胞培养的培养基和培养条件特点。

动物细胞的特性：

动物细胞没有细胞壁，适应环境能力差； 动物细胞的体积大，稍小于植物细胞；

大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性； 动物细胞的营养要求较为复杂。 动物细胞培养特点与培养方式：

动物细胞生长缓慢，细胞倍增时间15～100小时； 为防止微生物污染，培养过程中需要添加抗生素；

动物细胞由于无细胞壁，对剪切力敏感，必须严格控制培养控制条件；

大多数动物细胞具有锚地依赖性，适宜采用贴壁培养；部分细胞（如来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤和杂交瘤细胞，可采用悬浮培养；

动物细胞培养基成分较复杂、产品分离纯化过程繁杂，成本较高； 原代细胞培养50代后会退化死亡，需要重新分离；

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细胞贴壁:

培养贴附性细胞时,细胞要能贴附于底物上才能生长繁殖。 动物细胞培养方式：

悬浮培养（非锚地依赖性细胞） 固定化细胞培养（吸附法和包埋法） 贴壁培养（锚地依赖性细胞）（滚瓶培养，微载体系统）

动物细胞培养基的组成：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子。特殊成分为血清，常用小牛血清，添加血清有助于细胞贴壁和生长。 细胞培养的环境要求：

支持物：玻璃、塑料、微载体。

气体交换:大气氧含量，一般不需特别调整。二氧化碳调整到5％。

培养温度:确定最佳温度考虑动物体温、细胞所在身体部位、考虑一定的安全系数、细胞耐冷不耐热。

动物细胞培养工艺控制： 温度的控制：36.5±0.25℃； pH值的控制：pH7.0-7.6；

渗透压控制：动物细胞培养液应当与细胞内的渗透压处于等渗状态，一般控制在700～850kPa范围内；

溶解氧的控制：通过通入混合气体的量及其比例的方法进行调节控制，其中二氧化碳兼有供养和调节pH值的双重作用。

7. 蛋白类的酶提取过程，适用于酶蛋白分离的各种提取方法之分离原理等。如何保持分离过程中酶的活性？

1) 细胞破碎：机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法、酶促破碎法。 2) 提取：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取。

控制pH和温度，防止酶失活，也可加入保护剂，如与酶作用的底物、辅酶、某些抗氧化剂等。

3) 沉淀分离：盐析沉淀法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀、选择性变性沉淀

法。

4) 离心分离：差速离心、密度梯度离心、等密梯度离心。 5) 过滤与膜分离 6) 层析分离：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、层析聚焦。 7) 电泳分离：纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳。 8) 萃取分离：有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取、反胶束萃取。 9) 结晶：盐析结晶法、有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶法。 10) 浓缩与干燥:真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥。

8. 酶的改造方法：物理、化学、生物和人工模拟方法。

9. 酶分子修饰的主要方法和酶修饰的三种作用。

a) 方法：金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限

水解修饰、核苷酸链剪切修饰、氨基酸置换修饰、核苷酸置换修饰、物理修饰。

b) 作用：提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性。

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