PCR重点习题(3)

2．PCR基因扩增仪的工作关键是什么？经历了怎样一个发展过程？ 答：PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。

其发展过程为：水浴锅PCR仪属于第一代PCR基因扩增仪，以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系；压缩机PCR仪属于第二代PCR基因扩增仪，由压缩机自动控温，金属导热，控温较第一代PCR基因扩增仪方便；半导体PCR仪属于第三代PCR基因扩增仪，由半导体自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好；离心式空气加热PCR仪属于第三代PCR基因扩增仪，由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介，温度均一性好，各孔扩增效率高度一致。

3．PCR基因扩增仪按照变温方式的不同可分哪几类？分别有什么特点。 答：PCR基因扩增仪按照变温方式通常有以下三类：

（1）水浴式PCR仪：变温快、时间准、温度均一，但体积大，自动化程度不高。

（2）变温金属块式PCR仪：通过半导体加热和冷却，并由微机控制恒温和冷热处理过程。装置比较牢固耐用，温度变换平稳，有利于保持Taq DNA聚合酶的活性。

（3）变温气流式PCR仪：以空气作为热传播媒介，由大功率风扇及制冷设备提供外部冷空气而制冷。成本较低；安全程度高。微机配上软件，可灵活编程。

4．什么是梯度PCR仪？它有什么优点？

答：梯度PCR仪是由普通PCR仪衍生出的带梯度PCR功能的基因扩增仪。在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。使用梯度PCR仪，多次实验可在一台仪器上完成，既节省实验时间，提高实验效率，又节约实验成本。

5．何谓荧光实时定量PCR（RQ-PCR）技术？

答：荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术即在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实的反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

6．实时荧光定量PCR仪有哪些种类，各有什么特点？ 答：目前市场上实时荧光定量PCR仪一般可分三类。

（1）金属板式实时定量PCR仪：可容纳的样本量大，无需特殊耗材，但温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致。

（2）离心式实时定量PCR仪：能保障标准曲线和样品之间反应条件的一致性。但可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本。

（3）各孔独立控温的定量PCR仪：各孔独立控温，适合多指标快速检测。但是上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。

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7．PCR基因扩增仪的温度控制包括哪些方面？

答：PCR基因扩增仪的温度控制是决定PCR反应能否成功的关键，主要包括温度的准确性、均一性以及升降温速度等方面。

（1）温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性；（2）温度的均一性是指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性；（3）升降温的速度：升降温速度快，可以缩短反应进行的时间，提高工作效率，并提高PCR反应特异性。

对梯度PCR仪来说，除此以外，还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。 8．为什么反应管温控比模块温控更准确？

答：反应管温控模式下，仪器根据探测器所探测到的温控模块的温度由计算机计算出样品管内或PCR板孔内样品液的温度来进行控制。由于精确的算法能自动补偿时间，确保反应混合物按照程序设定的时间维持预设温度，所以准确度更高。

9．实时荧光定量PCR扩增仪的荧光检测系统主要由哪两部分组成？ 答：实时荧光定量PCR扩增仪的荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。 （1）激发光源：一般为卤钨灯光源或发光二极管（LED）光源。 （2）检测器：常用的是超低温CCD成像系统和光电倍增管（PMT）。 10．PCR扩增仪的热盖有什么作用？使用时应注意什么？

答：目前PCR仪通常都配备热盖，可使样品管顶部温度达到150℃左右，避免蒸发的反应液凝集于管盖而改变PCR反应体积。无需加石蜡油，减少了后续实验的麻烦。旋转加压的热盖需注意旋转压力的控制，过松则使热盖没有充分接触反应管而影响结果；过紧则会导致反应管变形，甚至可能造成热盖的机械故障。

11．简述PCR扩增仪的操作规程。

答：普通PCR扩增仪的操作通常为打开电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序，运行即可。定量PCR扩增仪的操作一般都是先打开PCR仪电源，再打开相连电脑中的相应软件，分别设置温度程序、采集通道，并可根据不同仪器的要求进行一些特殊设置，在仪器中放好PCR管，盖好仪器，运行设置好的反应程序。关机时通常先关软件，再关PCR仪，最后关电脑。

12．定量PCR扩增仪常见故障有哪些，如何解决？ 答：定量PCR扩增仪常见故障及解决方法为：

（1）荧光染料污染样品孔，解决方法是请工程师清洁样品孔；（2）PCR管融化，原因可能是温度传感器出问题或是热盖出问题，需工程师检修；（3）个别孔扩增效率差异很大，需工程师检修；（4）荧光强度减弱或不稳定。需更换光源；或需工程师调试检修；（5）仪器工作时噪音不正常，可自行检查PCR

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管是否放好；或请工程师检修；（6）仪器采集荧光时噪音不正常。需工程师检修，或更换配件；（7）机器搬动过后不能正常工作或不能正常采集荧光信号。请工程师重新调试。

13．简述PCR基因扩增仪的实际应用。

答：PCR基因扩增仪广泛应用于医学领域，主要包括：感染性疾病的分子诊断和研究；遗传性疾病的分子诊断和研究；恶性肿瘤的分子诊断和研究； PCR扩增仪在移植配型上的应用；PCR扩增仪在法医学上的应用；PCR扩增仪在分子生物学中其他领域的应用。

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