CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

? 1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液

体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；

? 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振

荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； ? 3、培养物于冰上放置20min；

? 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的

0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；

? 5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的

0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；

? 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 μL冰冷的

0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；

? 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置

12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

1． 前夜接种受体菌（DH5?或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；

2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；

3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上 操作；

4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；

6 ．弃去上清，加入100?l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟；

8 ．弃去上清，加入100?l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮；

9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超 低温冷冻贮存备用（－70℃）。

注意事项

1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使

用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；

2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；

3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的 推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的 活菌数随时间延长而减少造成的）；

4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子

（如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；

5 ．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能 大大降低细菌的转化效率；

6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；

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