研究生分子生物学实验讲义

实验一 人外周血淋巴细胞总RNA的提取、电泳

一、实验目的

学习并掌握人外周血淋巴细胞总RNA的分离提取及琼脂糖凝胶电泳检测方法。

二、实验原理

细胞的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多（占80%~85％）。在pH 6.0微酸环境下，RNA相对稳定，碱性环境下，易分解。

RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA，因而在RNA提取及相关分析实验中，如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。

在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：1）样品新鲜，保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase；2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯；3）空气中灰尘和细菌含RNase，应建立干净的操作环境；

实验介绍如何使用Takara公司的RNAiso Plus试剂来分离人外周血淋巴细胞的总RNA。 RNAiso Plus是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase失活的异硫氰酸胍，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA降解。（注意：RNAiso Plus具有强烈腐蚀作用，小心操作。）

三、实验材料、试剂与器材

1、人外周血淋巴细胞（5х106） 2、DEPC水溶液，PBS，TAE 3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯 4、RNAiso Plus试剂购自Takara公司

5、无RNase的枪头（1000、200、20 ul），离心管 (0.2ml、0.5ml PCR管 ,1.5ml、2ml、7ml离心管)。

6、PE手套、离心机

四、实验步骤 1.RNA提取前的准备 1）、塑料制品的处理：

0.05-0.1%的DEPC （焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜：

? 必须保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头、0.2ml、0.5ml PCR

管，必要时应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作）。

? 泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸

密封杯口；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。 ? 121℃，30分钟高压灭菌，以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作

用而破坏mRNA活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用。

? DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑

制酶活性。具强挥发性，致癌物,因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。 2）、试剂的配制：

试验所用试剂也可用DEPC处理过夜，再高压灭菌,但 DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，可用DEPC处理的水配制，并尽可能用未曾开封的试剂，然后高压灭菌。 所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。

0.05-0.1‰的DEPC水（三蒸水），磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜，121℃，30分钟高压灭菌。

2.RNA的提取：

用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞（PBMC），体外培养

取5х10个体外培养的PBMC悬液置于EP管中，离心收集细胞沉淀

向EP管中加入1ml RNAiso Plus裂解细胞，用移液枪反复吹吸，直至裂解液中无明显沉淀

6

室温（15-30℃）静置 5 分钟，然后从核蛋白中分离 RNA

加入氯仿（RNAiso Plus 的 1/5 体积量），盖紧离心管盖，混合至溶

液乳化呈乳白色，室温静置 5 分钟

12,000 g 4℃离心 15 分钟。从离心机中小心取出离心管，此时溶液分为三层，

即：无色的上清液（含 RNA） 、中间的白色蛋白层（大部分为 DNA）及带有颜色的下层

有机相。

小心吸取上层无色水样层转移至一新EP管中

向上清中加入 0.5-1 倍 RNAiso Plus 体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，

室温下静置 10分钟。

12000g，4oC离心10min，轻轻倒去上清

加入与 RNAiso Plus 等量的乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500r/min，4oC离心5min

弃上清，倒置EP管，5-10min空气干燥（勿完全干躁，难再溶），加入20ul的DEPC水溶

解沉淀 注意：异硫氰酸胍是很强的蛋白变性剂，但它不能使RNA酶发生不可逆失活。因此，假如

去蛋白后，样本被残余的RNA酶污染，这些酶会在变性剂去除后，重新恢复活性。因此，将水相中RNA彻底从有机相中分离出，并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染，这点很重要。

3、琼脂糖凝胶电泳检测

1）、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后，以DEPC处理的水冲

洗，备用；

2）、以DEPC处理的水稀释50хTAE（DEPC处理的水配制，高压灭菌）为1хTAE

备用；

3）、用以上1хTAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶； 4）、电泳 5V/cm 电泳20min

5）、电泳完毕后，在凝胶成像系统上照相分析，电泳图谱：28s和18 s条带清晰、

28s亮度是18s亮度的2倍以上

实验二 反转录-聚合酶链式反应 （RT-PCR）扩增CCL-17基因

一、 实验目的

通过本实验掌握RT-PCR工作原理及操作方法。

二、 实验原理

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 是间接对某一特定的RNA分子的扩增，可分作相对独立的两个步骤：即RT（将mRNA反转录成cDNA）和PCR（通过聚合酶链式反应扩增特定的cDNA）。其原理是：由总RNA或poly(A) +RNA(mRNA) 采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以此cDNA为模板以特定的寡核苷酸作引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因。

本实验通过RT-PCR法扩增的基因为人趋化因子17基因，即CCL-17，该基因编码的CCL-17蛋白是一种由人淋巴细胞分泌的细胞因子，具有趋化T淋巴细胞定向移动的生理功能，在抗肿瘤免疫中有重要作用。

（一）、反转录酶的选择：

1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱；2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性；3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构；4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

（二）、合成cDNA引物的选择：

1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物

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