红 细 胞 血 型 血 清 学 试 验

红 细 胞 血 型 血 清 学 试 验

安徽省合肥市第一人民医院输血科 林正民 江建锋 陈玲 梁晓浏

IgG抗A（B）测定

【原理】

血清以巯基乙醇（2-mercaptoethanol,简称2-me）处理后，IgM抗体分子裂解为6-7 S 亚单位。此种亚单位虽然仍保持与抗原结合的能力，但已失去与相应红细胞凝集的作用。IgG抗体分子则不被2-me灭活，保持与相应红细胞致敏的血清学特性。IgA抗体分子可部分被灭活（7S亚单体不受影响，9 S及11 S多聚体被灭活）。 【试剂】

1、0.2mol/L 2-巯基乙醇应用液

取巯基乙醇1.6ml以pH 7.4 PBS（KH2PO4 1.73g, Na2HPO4·12H2O 19.35g, NaCl 8g加蒸馏水至100ml）稀释到100ml，分装安瓿，每支1ml或2ml,冰箱保存备用。 2、受检者血清。

3、5%A型和B型红细胞PBS（或生理盐水）悬液。 4、抗人球蛋白血清。 【操作】

1、吸取受检者血清0.4ml，加2-me应用液0.4ml，混合，将试管口塞紧，置37℃水浴中2h。 2、排列小试管（10mm×60mm）两排，每排10支，第一排每管各加pH 7.4的PBS 0.4ml。 3、第1排第1管加2-me处理血清0.4ml，混合，吸出0.6ml，移0.2ml至第2排第1管内，其余0.4ml移入第1排第2管内，混合。以此类推，作倍量稀释至第10管，每管内留有1:2, 1:4, ? 1:1024不同稀释度的血清各0.2ml。

4、第1排每管各加5%A型红细胞悬液0.2ml，第2排每管各加5%B型红细胞悬液0.2ml，置37℃水浴温育1h。 5、结果观察

如在前几管内发现有红细胞凝集者，是由于高效价IgG抗A(B)或IgA抗A(B)所引起，称为“盐水效价”。

6、其余红细胞未见凝集的试管，再以pH 7.4 PBS洗涤3次，除去洗涤液，留取压实红细胞。 7、每管各加pH 7.4的PBS 2滴，混合。

8、每管各取1滴，分别移至另一排小试管中，再各加最适稀释度抗人球蛋白血清1滴，混合。

9、1000r/min离心1min。

10、轻轻摇动试管，观察结果，红细胞凝集的最高稀释度的倒数即为IgG抗A或抗B效价。 【附注】

1、本法常用于ABO血型IgG抗A或抗B效价的测定，如ABO新生儿溶血病母亲血清中IgG抗A(B)的测定。 2、二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）也可用于灭活IgM抗体，以测定IgG抗体。方法：0.01mol/L DDT(0.77 g DTT溶于500ml等渗盐水)与等量受检者血清混合，置37℃水浴30min，再以此处理血清进行试验。DTT的优点为无恶臭味，反应快速，但对强抗体灭活效果较差。

抗球蛋白试验

抗球蛋白试验（antiglobulin test,AGT）又称Coombs试验，是检查不完全抗体的一种很好的方法。将抗球蛋白血清（antiglobulin serum，AGS）加入已致敏的红细胞盐水悬液中，红细胞表面的抗体球蛋白（使其致敏的不完全抗体）与抗球蛋白血清中的抗体发生特异性反应，使红细胞发生凝集。抗球蛋白血清除了可以测定红细胞上的IgG抗体外，还可以测定IgM和IgA，也可以测补体组分（C3、C4）。所谓广谱AGS即包括抗IgG和抗C3。

（一） 直接抗球蛋白试验

【原理】 利用抗球蛋白血清可与体内已被不完全抗体或补体致敏红细胞产生凝集反应，用于检查红细胞是否已被不完全抗体所致敏，如新生儿溶血病（胎儿红细胞被母亲血型抗体致敏）溶血性输血反应（输入的不相合红细胞被受血者不完全抗体致敏）自身免疫性溶血性贫血（患者红细胞被自身抗体致敏）以及药物诱导产生的自身抗体（由甲基多巴类药物、青霉素等所致）。 【试剂】

1、抗球蛋白血清（广谱及单价），市售合格产品。

2、用不完全抗D致敏的5% Rh(D)阳性红细胞盐水悬液供阳性对照用。取3人O型红细胞，混合，经盐水洗涤后取压紧的红细胞，加等量抗D血清，置37℃水浴致敏30min,取出后离心去除上清液，以生理盐水洗涤3次，最后再用盐水配成5%红细胞悬液。 3、正常人5% D阳性红细胞悬液（未致敏），供阴性对照用，除不用抗D血清外，按上法配制。 【操作】

1、取受检查红细胞，以生理盐水洗涤3次，末次洗涤后，将上层盐水倒尽，再以滤纸将管口附着的盐水吸去，配成5% 红细胞盐水悬液。

2、取上述5% 受检者红细胞盐水悬液1滴，移入1小试管（10mm×60mm）内，加抗球蛋白血清1滴，混匀。 3、阳性对照：用不完全抗D血清致敏的5%D阳性红细胞悬液1滴加抗球蛋白血清1滴，混匀。

4、阴性对照：正常人5% D阳性红细胞悬液1滴加抗球蛋白血清1滴，混匀。 5、受检者以及阳性、阴性对照管同时以1000 r/min离心1 min，轻轻侧动，观察结果。 6、结果判定 如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，则受检者红细胞凝集者为阳性，不凝集者为阴性。 【附注】

1、标本采集后立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞上丢失。

2、抗球蛋白血清应按照说明书使用最适稀释度，否则可产生前带和后带反应，而误为阴性结果。

3、也有将浓的抗人球蛋白血清在白瓷板上做倍量系列稀释，再各加受检者10% 洗涤红细胞悬液1滴，不断转动瓷板，肉眼观察凝集反应。凡出现凝集的最高稀释倍数的倒数即为直接抗球蛋白试验效价。这种效价并不表示受检者红细胞被不完全抗体致敏的强度。

4、受检红细胞一定要用盐水洗涤3次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假

阴性结果。

5、最好对阴性结果进行核实：即在试管中再加1滴IgG致敏红细胞，如果为阳性则表示试管内的抗球蛋白血清确未被消耗。

6、如需了解在体内致敏红细胞的免疫球蛋白类型，则可分别以抗IgG、抗IgM或抗C3单价抗球蛋白血清进行试验。 7、红细胞上吸附抗体太少，或Coombs阴性自身免疫性溶血性贫血直接抗球蛋白试验可呈假阴性反应。

8、全凝集或冷凝集血液标本及脐带血标本含有Wharton胶且洗涤不充分，血液标本中有很多网织红细胞，且抗球蛋白血清中含有抗运铁蛋白时，都可使红细胞产生凝集，出现假阳性。

（二） 间接抗球蛋白试验

【原理】 本试验是一种检测血清中不完全血型抗体或补体的方法。即用已知抗原的红细胞测定受检者血清中相应的不完全抗体，或用已知的抗血清测定受检红细胞上相应抗原。常用血型鉴定、抗体的检出和鉴定、输血前交叉配血试验以及其他的特殊研究。 【试剂】

1、抗球蛋白血清（广谱及单价）。 2、受检血清，或已知抗体的血清。

3、5% 已知抗原的红细胞悬液，或5%受检红细胞悬液。 4、IgG抗D血清。 5、 AB型血清。 6、 5% D阳性红细胞悬液。 【操作】

1、取试管3支，标明受检管，阳性对照及阴性对照。 2、按表1将各反应物加入相应试管内。

3、混匀，置37℃水浴1h，用生理盐水洗涤3次。末次洗涤后，将上清液除尽，并用滤纸将附着于管口的盐水吸去。每管再各加生理盐水1滴，混匀。

4、每管各加适当浓度抗球蛋白血清1滴，混匀，1000r/min,离心1min，观察结果。

表1 间接抗球蛋白试验操作步骤

反应物 血清（已知或受检） 5% 红细胞悬液（受检或已知）

IgG抗D血清 AB型血清 5%阳性红细胞悬液

5、结果判定 阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检管出现凝集者为阳性，表示受检血清中有不完全抗体，或受检红细胞上有相应抗原。如阳性或阴性对照出现不规则结果应分析原因，重做。

6、效价滴定：如果受检者血清中检出不完全抗体，可将受检者血清以盐水做倍量稀释后，按上法进行测定。

受检管 2滴 1滴 - - -

阳性对照

- - 2滴 - 1滴

阴性对照

- - - 2滴 1滴

【附注】

1、经研究发现：血清与相应红细胞在37℃水浴中致敏的时间，如致敏1h，75% 的抗体吸附于红细胞上，如致敏时间延长达2h，则抗体吸附达90%，如以低强度离子盐水溶液（LISS）代替生理盐水配制5% 红细胞悬液，则致敏时间可缩短，大多数抗体经致敏15-30min即可，但康Fy和抗Jk抗体需较长孵育时间。 2、红细胞洗涤应迅速，一开始洗涤就不应中途停止。洗涤用盐水要足量并用力冲入管底，使压积于管底的红细胞松解。切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防污染来自皮肤的蛋白。据研究，其量即使只有1：4000稀释，即可中和抗球蛋白血清1滴。

3、离心速度和时间十分重要，应按规定进行，原则上应以最小的离心力和最短的离心时间能使阳性对照管出现阳性反应为宜。

4、如果检查的抗体为补体依赖抗体，则必需加入新鲜AB型血清，抗球蛋白血清中也应含有抗C3。

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