环境胁迫对拟南芥KCS基因表达的影响

环境胁迫对拟南芥KCS基因表达的影响

摘要：以拟南芥为材料，通过研究低温环境下野生型和突变型拟南芥KCS基因的表达来分析低温胁迫对拟南芥KCS基因表达的影响。 关键词：拟南芥；KCS基因；PCR扩增

引言：以拟南芥为材料，研究低温胁迫环境下的野生型和突变型拟南芥KCS基因表达的影响，通过Trizol法提取拟南芥总RNA，并以mRNA分子为模板，以寡聚（dt）为引物，合成cDNA，并将制备的cDNA采用PCR的方法扩增为特异基因片段，最后通过琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥KCS基因的表达。根据电泳图进行结果分析低温胁迫对拟南芥KCS基因的表达影响。

1.材料与方法 1.1材料

常温与低温16℃培养四天的野生型、突变型拟南芥 1.2引物

1.2.1引物的设计

PCR引物设计的目的就是要找到一堆合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。使用引物设计软件NTI 9.0,PRIME 5.0等长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为18～21个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要。

两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。

引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。

(G+C）%含量:引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。

1.2.2引物的合成：找专门的生物公司进行引物合成 1.2.3引物的特异性：

引物的设计与合成对 PCR 的成功与否起着决定性的作用 1.2.3引物的浓度： 引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性;引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。一般认为 PCR 反应中引物的终浓度为 0.2 ～ 1μmol/l 为宜 1.3RNA提取、鉴定

分离纯化植物RNA是植物分子生物学和基因工程的基本技术，在通过反转录合成cRNA的基因克隆技术、研究基因表达的Nothern blotting分析或RT-PCR分析、研究转录始点的引物延伸分析等多方面具有重要的的用途。本实验是运用简单、高效而实用的Trizol法提取植物总RNA的基本技术。

1.3.1Trizol提取拟南芥总RNA 的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。Trizol法是对1987年Chomczynski和Sacchi提出的基于异硫氰酸胍一步法抽提RNA方法的改进，主体成分是异硫氰酸胍与酚的混合物，是一种高浓度变性剂。液氮下磨细的组织样品加入到Trizol中后，在用力混匀下，蛋白迅速变性，多数杂质形成沉淀相，由于溶液呈酸性，DNA也形成沉淀。加入氯仿后，有利于酚的去除，同时有利于含RNA的水相与有机相和杂质相的分相。离心去除杂质，通过异丙醇沉淀RNA，适当洗涤后即可溶解RNA。

1.3.2Trizol提取拟南芥总RNA 的提取

(1).匀浆化作用 8000rpm 离心2min收集细胞，弃上清；加入500uL的TRIpure,用振荡器震荡至无明显沉淀,室温静置5min.

(2). 分离阶段 向匀浆样品中加入0.1mL氯仿，剧烈震荡15s，室温下孵育2-3min，12000g离心15min，吸取上清至新Ep管。

(3). RNA的沉淀 向上清中加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀,室温孵育10min， 12000g离心10min，弃去上清液，可见胶状沉淀。

(4). RNA的漂洗 加500微升75％乙醇洗涤沉淀一次，轻轻上下颠倒洗涤， 12000g离心5min,弃去乙醇.

(5). RNA的再溶解 空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uL RNase-Free处理水，充分溶解。

1.3.3Trizol提取拟南芥总RNA 的鉴定 电泳检测：取2-5μl RNA，加1μl 6×上样缓冲液混匀，以DL2000 DNA marker作为分子量标准，在1×TAE缓冲液中于120V进行琼脂糖凝胶电泳，于紫外分析仪中观察并拍照，从主带有无和亮度、主带之间的比例、降解带的有无和亮度、DNA污染情况等检查RNA的质量；

分光光度法检测和浓度测定： （1）预热紫外分光光度计10—20分钟。

（2）取两只比色杯，一只装入1ml H2O溶液，作为空白溶液，用来校正分光光

度计零点及调整透光度至100。 （3）RNA纯度及浓度测定：

① 取2ul DNA或RNA样品加入另一比色杯，加dH2O 至1000ul, 混匀。 ② 将两只比色杯置分光度计中，调入射光波长，分别用空白溶液调整零点（T为100，OD为0），测定待测样品液在260nm、280nm、230nm的OD值。

③计算浓度：对于双链DNA 1 OD260=50ug/ml 对单链RNA 1 OD260=40ug/ml。

④测定纯度：

纯的RNA溶液其OD260/OD280的比值应介于1.7至2.0，OD260/OD230的比值应大于2.0。RNA样品OD260/OD280的比值太小，说明有蛋白或苯酚污染；比值大于2.0，则可能被异硫氰酸胍污染。OD260/OD230的比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。

纯的DNA溶液其OD260/OD280应为1.8，OD260/OD230应大于2.0。OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染，小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。

1.4PCR扩增体系与程序

1.4.1逆转录-聚合酶链反应（PCR）原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

1.4.2PCR扩增步骤

1、在超净工作台上吸取1ml无菌水到EP管中，加入2μl植物总RNA溶液，充分混匀，在紫外分光光度计上测定260、280nm的光吸收值(OD值)，然后计算RNA的浓度,并分析其纯度。

2、在DEPC处理过的Ep管中加入约4μg总RNA和1μl 0.5μg/μl的 Oligo(dT)18 primer，小心混匀，70℃保温５分钟，立即浸入冰水中。

3、按次序分别加入下列试剂： 5μl 5×M-MLV RT Buffer、2μl dNTP mix(2.5mM)、1μl RNase抑制剂(30U/μL)、1μl M-MLV Reverse Transcriptase，然后加DEPC水到25μl.

4、小心混匀，室温离心5秒，将所有溶液收集到管底， 37℃保温1小时。 5、90℃处理5分钟，冰上冷却。

6、在0.5mLEppendorf管内配制25uL反应体系并混匀： 反应物 体积／uL ddH20 18.75 10xPCR缓冲液（Mg2+） 2.5 dNTP（10 mM） 0.5 引物1（10uM） 0.5

引物2（10uM） 0.5 模板DNA 2

Tag酶（2U/L） 0.25 7、按下述程序进行扩增

① 94℃预变性 2 min； ② 94℃变性 30s ③ 52℃退火 30s；

④ 72℃延伸 30s； ⑤ 重复步骤②-④35次； ⑥ 72℃延伸5min。

8、称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 mL1xTBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液；加入GoldView核酸染料5ul。

9、胶板的制备：将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子；将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)；待胶凝固后，取出梳子，并放在电泳槽内，加人电泳缓冲液至电泳槽中。

10、加样：用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。

11、电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V／cm。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。

12、紫外灯下检测并照相：在紫外灯(360nm，312nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出绿色荧光条带。 2、结果与分析

2.1RNA的提取结果

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。样本RNA的纯度可采用分光光度计进行分析纯的RNA溶液其OD260/OD280的比值应介于1.7至2.0，OD260/OD230的比值应大于2.0。RNA样品OD260/OD280的比值太小，说明有蛋白或苯酚污染；比值大于2.0，则可能被异硫氰酸胍污染。这些有机物的存在会干扰后续的分子生物学反应，影响基因表达数据的质量。OD260/OD230的比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。

在RNA完整性方面，最廉价的检测方法是对少量样本进行琼脂糖凝胶电泳。完整的总RNA经变性凝胶电泳后会有明显的核糖体RNA主条带。28S rRNA条带的亮度大约是18S rRNA的两倍，2:1这一比值（28S∶18S rRNA）可以作为衡量RNA完整性的很好指标(当然这一规律并不适合于所有物种)。部分降解的RNA条带呈弥散状，核糖体RNA主带不明显或者28S∶18S比值偏低。严重降解的RNA在低分子质量区域弥散分布，基因组DNA污染呈现出可见的高分子质量条带。

实验分为拟南芥野生型常温组、低温组；突变型常温组、低温组，一共四个组，各小组实验RNA纯度测定数据（部分数据丢失）如下： 组号 1 2 3 4 5 6 7 8 13 14 16 20 OD260/OD280 1.36 1.59 1.59 1.64 1.69 1.33 1.63 - 1.45 1.50 1.80 1.58 OD260/OD230 0.28 0.49 0.49 0.54 - - 0.69 0.49 0.21 - 0.46 0.37 电泳图如下图所示：

拟南芥野生型常温、低温电泳图

拟南芥突变型常温、低温电泳图

实验结果分析：

实验结果如上所示，从电泳图中可以观察到，mark旁的一系列电泳带，其中野生型第5条和突变型第4条几乎不可见，说明RNA严重被污染，已几乎降解充分，说明可能实验过程中产生了一定的误差，可能是被外源RNase或蛋白质所污染；野生型第1、2、3条只能清楚看到18S rRNA条带的亮度最大，说明RNA也部分被降解；野生型第6条28S rRNA条带的亮度稍大于18S rRNA条带的亮度，说明完整性稍好于其余条数，降解程度稍低；野生型第7、8、9条28S rRNA条带的亮度与18S rRNA条带的亮度相当，比值偏小，说明

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