答辩问题总结分发稿

基础问题；实验问题；实验设计问题； 本文的贡献 创新点

PCA 和 PLS-DA，

PLS=DA为什么要做过拟合检验

如果建立模型时使用的主成分数过少，就不能反映未知样品被测组分产生的光谱数据变化，其模型预测准确度就会降低，这种情况称之为不充分拟合。 如果使用过多的主成分建立模型，就会将一些代表噪音的主成分加到模型中，使模型的预测能力下降，这种情况称之为过度拟合。 采用交互验证的方法检验模型的内部稳健性和拟合效果

查一下文献说明核磁不仅可以应用与纯物质的结构解析，也可以应用于混合物的分析。（有人质疑核磁方法找到标记物的实用性） 核磁方法用于代谢组学的历史以及广泛应用的程度。 英国尼克森最早使用核磁共振的方法做代谢组学研究 美国科学家最早做采用液质联用的方法进行代谢组学研究

代谢组学分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学性质差异很大，要对他们进行无偏向性的全面分析，单一的奋力分析手段难以胜任。核磁方法对含氢化合物的具有普适性的特点，1H因具有非常高的丰度和良好的共振特征而应用最广泛。图中的峰与化合物中的氢一一对应，信号的强弱还可以定量分析。但是对于大多数生物有机物，要想阐明其完整的结构信息，仅仅依靠一维核磁谱图是不够的，还应该应用同核二维和异核二维谱来解析结构，异核二维谱对未知物的鉴定极为重要。目前还是主要依据操作者的经验和熟练程度，代谢物的鉴定是代谢组学发展的瓶颈。有待于进一步完善。 核磁分析法中标记物的鉴定过程，举例子。

通过与标准品德谱图进行对比，文献参考，在线数据库检索。

根据峰裂分情况并结合特征化学位移，比对特征峰位，峰形，确定峰归属。例如在线数据库检索到3-羟基丁酸在化学位移1.20的位置有一个双峰，丙氨酸在化学位移1.47处有一个双峰，从本实验得到放大的氢谱中可以看出化学位移1.16和1.48处均有双峰，所以推断该化学位移处是3-羟基丁酸和丙氨酸。

液质联用法方法学考察的具体方法，简述方法学考察的优缺点（选取离子法和主成分分析法）。方法学考察的方法以及QC样品有什么要求，提取离子的选择原则是什么：提取离子保留时间和峰面积的RSD和 RE值；PCA分析（对总离子流色谱图全谱进行的处理）混合样品，保留时间，峰面积，分离情况，标志物和非标志物

如何寻找生物标记物，鉴定的依据是什么，方法是否可靠，生物标志物峰的指认 Loading中散在外面的点可能是标记物，通过统计分析T test确定有显著性差异的化合物才是生物标志物。代谢物的鉴定是通过分析一、二级质谱信息、在线检索一些数据库，如HMDB （www.hmdb.ca）、METLIN （http://metlin.scripps.edu）、MassBank （http://www.massbank.jp） 和 KEGG （http://www.kegg.jp）等，及与对照品比对而鉴定的。提取该离子的提取离子色谱峰应是一个具有成型且分离度良好的色谱峰。 核磁方法学的问题

1H NMR是最早应用于代谢组学研究的分析方法，样品前处理，数据采集参数已经成熟，应用广泛，故未对其进行方法学考察。如果做方法学的话应该包括实验温度，缓冲液的浓度，预饱和功率，加内标和外标的方法。

核磁方法中样品与处理中磷酸缓冲盐的作用是什么？TSP 的全称和作用是什么？

磷酸盐缓冲液的作用是维持稳定的pH值，防止pH对样品中具有离子化基团的分子的化学位移产生影响（-NH2,-COOH）。 重水的作用：锁场。

TSP：定标化合物，因为该化合物在核磁分析中化学位移是0。

3-三甲基硅基丙酸钠 TMS DSS

核磁共振法分析过程：

调谐-匀场，锁场-选择脉冲序列-设置参数-采样 数据预处理：

去噪，溶剂峰消除，相位校正，基线校正，分段积分，归一化，标准化。

血-CPMG：消除蛋白质类大分子物质的干扰 尿-NOESY：压制水峰

液质联用的峰匹 配，峰对齐、归一化是怎么做的？

用Masslnyx 软件处理的，在Edit method 项下操作，最重要的是设定保留时间和质荷比的偏差范围，eg ±0.5. 生物标志物水平的变化是依据什么

液质联用法是根据相对峰面积的强度，核磁法是依据积分得到的面积。看一个变量的水平在不同组别大鼠中的变化趋势。 代谢组学内标的选择

代谢组学分析的是生物样品的全谱。UPLC-MS法找一个合适的内标是很困难的，因此一般不选内标，采用总面积归一化。GC-FID一般选择烷酸类比如十七烷酸做内标，数据处理采用内标归一化法（标志物峰面积除上内标的峰面积）。核磁法选TSP做内标，化学位移是零。如果做定量分析则一定要选择内标，比如做溶血磷酯酰胆碱类的定量分析，则要选择体内不含有的胆碱类作为内标。内标的选择和使用将严重影响定量的准确性。

模型的选择以及模型建立成功的考量标准，大鼠的分组，空白对照法，还是自身对照法（消除个体差异，适合造模时间短的模型，）

给药剂量的选择，怎么没有做剂量依赖性？阳性对照药材选择原则，为什么本实验没有采用阳性对照药材。

阳性对照组通常是将模型动物给予一定的确实有效的药物加以处理，看看其治疗效果如何？阳性对照药的目的，就是看在此模型状态下，药物是否对之有效？假如阳性对照药都没有效的话，那可能此模型或者给药方式有问题；而阳性对照药有效，被测试的药物没有效，则说明被测药物不行。另一方面，被测药物与阳性药物对照，可看出孰优孰劣。因此，经此对比，可以突出被测药物的作用。但，并不是每一个实验都能找到阳性对照药，也不是每一个实验都需要设置阳性对照组。

阳性药物对照试验是将受试药物与已知的活性有效药物进行对照的临床试验，根据试验的目的常分为优效性试验和非劣效性或等效性试验两种。试验设计的关键，是通过阳性药物对照来证明受试药和对照药之间的差别（优效性），或

证明两药之间的非劣效性或等效性。一般而言，为观察受试药物作用是否存在、为比较两种药物疗效和安全性的临床试验中，通常采用阳性药物进行对照。

阳性对照药物必须能被试验所在区域接受，必须是在相关专业领域内得到学术界公认的、对所研究的适应症疗效最为肯定并且是最安全的药物，特别是在最近药典中收载的药物。原则上应选择与受试药有相同结构、相同药理作用、相同作用机制、相同剂型、相同给药途径的已在国内上市的同一类药物。

补充对照品和对照药材：首先要明白做定性鉴别的目的，是为了防止伪劣药材，如果一个药材里面含有一个化合物成分，比如说 黄连含小檗碱，我们以小檗碱作为对照品，如果我们仅仅以小檗碱做对照品进行定性鉴别，那么有一个情况不得不考虑，用一些特殊手段在伪劣的黄连药材中加入小檗碱，你做薄层鉴别黄连是合格的，甚至你用hplc做含量都是合格的。但是用对照药材就可以清晰的辨别出黄连的伪劣。（一个对照品就一个斑点，而对照药材是鉴定过的药材，有很多斑点。比如说黄连和黄柏含小檗碱所以用小檗碱作为对照品是不够的） 钙滴定方法的确定

钙测定法采用原子吸收光谱法和EDTA络合滴定法，查了一些文献，由于有些试剂难以买到，比如氰化钾，而不能重现，因此我们参考熊志立和王大为论文中的方法做的。钙指示剂的配置方法，文献报道有三种，0.15%的丙酮-水（1:1）溶液，0.5%的乙醇溶液，钙羧酸指示剂-NaCl固体（1:50）研匀，固体指示剂稳定且终点敏锐。指示剂用量少许即可。

滴定剂的浓度和用量问题。EDTA经氧化锌（ZnO标定） 磷测定方法的确定以及细节问题

紫外-可见分光光度法的选择：查阅文献后得知，文献中有采用微波消解法和酸碱滴定法，我们对微波消解法不是很熟悉，酸碱滴定法引入多种酸碱指示剂，若终点判断有误差和滴定体积有误差，会引入很大的误差。所以我们采用2005版药典中的方法测定骨中的有机磷的含量。 紫外-可见分光光光度法条件摸索：

显色剂的种类，用量，显色时间，波长选择等。因为采用的是药典的方法因此没有经过条件摸索。

显色剂的用量，应该是定量过量的，对待测物来说是定量过量的。本实验没有考

察显色剂用量，而是将骨溶液的浓度控制在线性范围内，直接使用原来的显色剂量。

紫外-可见分光光光度法方法学考察：

试剂空白：用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样的方法处理。 含量测定方法的采用：标准曲线法。

做出的标准曲线，如果截距足够小就可以用外标一点法。将标准曲线的最低点代入标准曲线方程，如果ax项是b项的20倍，则可以采用外标一点法。若果截距不够小，则将测得值带入标准曲线计算。但是样品一天测不完，则需每天随行一条标准曲线。

肾组织样品预处理方法的问题

方法的摸索：梯度洗脱程序，提取方法（匀浆，液液萃取），提取试剂（氯仿-甲醇不同比例，乙酸乙酯） 蛋白质浓度的测定原理及方法总结

蛋白质溶液浓度测定方法有多种,一、双缩脲法 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法,至令仍广泛采用.在需要快速,但不很准确的测定中,常用此法。 一、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法,至令仍广泛采用.在需要快速,但不很准确的测定中,常用此法.硫铵不干扰显色,这对蛋白质提纯的早期价段是非常有利的.双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收.双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定.干扰物有硫醇,以及具有肽性质缓冲液,如Tris、Good缓冲液等.可用沉淀法除去干扰物,即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质,然后弃去上清液,再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定. 二、Lowry法

此法是双缩脲法的进一步发展.他的第一步就是双缩脲反应,即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物,然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂）,结果得到深蓝色物.此法比双缩脲法灵敏得多,适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液.其干扰物质与双缩脲法相同,而且受他们的影响更大,硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差.另外要注意的是,加入福林试剂时要特别小心,试剂只在酸性pH环境中才稳定,上述提到的还原反应只有在pH10时才发生,因此,福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时,必须立刻搅拌,以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原. 三、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故,因此,利用这个特异性吸收,可以计算蛋白质的

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